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        Pichia酵母表达系统操作方法

        互联网

        1599

        我先说我有的质粒和菌株:PPIC9K,PPIC9,PPICZahphaA,B,C
        以及一个改造的PPIC9K载体,EcoRI和BamHI双酶切,C末端引入了一个6histag
        菌株:GS115,KM71,X33,以及十几个空载体对照菌株
        我的酵母表达Protocol:
        >10ug质粒用Sal线性化,加1/10体积的3M NaAC PH5.2和3倍体积的乙醇沉淀
        70%乙醇洗一遍,20ul ddH2O重溶
        按照公司手册做电转化感受态,一般OD600到1.1-1.3,0.2cm转化杯中电转化
        每个样品涂5块左右10cm的MD板,一般有>1000个转化子
        足够用不同浓度的G418板筛选,一般做0.5,1.0,2.0mg/ml梯度或干脆用1.0
        然后每个样品从G418板上挑10个左右单克隆于2ml BMGY摇菌(30ml玻璃管,比LB管大一点),纱布一般用8层,一天左右看着比较浑
        离心,留样1ml,余1ml换2ml BMMY诱导表达,3,4层纱布足够了
        一般1-2天收集表达上清,稀释一定比例铺板做ELISA检测
        一般都在蛋白的C末端加入了6个his,用抗histag抗体检测,4个小时出结果
        和GS115空菌株做对照,根据阳性值高低判断蛋白表达量
        挑选阳性值最高的克隆大量表达,纯化蛋白
        从抽质粒做感受态开始,整个过程顺利的话两个星期内出结果
        我一般连鉴定Mut+和Muts表型都省了,SalI线性化绝大部分都是Mut+表型
        另外表达上清用TCA浓缩跑电泳鉴定也是一种方法,但是重复性不好
        至于蛋白有没有表达就要看你的运气了,一般重复2-3次实验都没有表达菌株,这个蛋白就放弃表达了


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