染料法qPCR常见问题及解决方案

 

在染料法RT-qPCR实验中，难免会遇到一些奇怪的扩增曲线或熔解曲线，不管是开辟新课题新项目中的预实验探索还是持续验证中的反复测试，都有可能遇见。为此小翌整理出来常用的SYBR Green染料法RT-qPCR实验的几个常见问题，并给出了可能的原因和解决方案，希望大家能够顺利度过RT-qPCR大关。

一.扩增曲线异常

正常的扩增曲线一般呈S型，一般建议有效 Ct 值控制在15‑30，特殊低丰度基因 Ct 可适当放宽。异常的扩增曲线包括Ct值偏大，扩增曲线无平台期、曲线呈锯齿状等现象。

1.Ct值偏大（如Ct值＞30）

 

可能原因与解决方案：

1）模板量低或基因表达丰度低，建议增加模板量观察Ct值能否成相应倍数减少。

2）qPCR整个反应条件不适宜或引物设计不当导致扩增效率低，建议通过标准曲线确认扩增效率。

3）扩增产物过长，建议用三步法程序扩增或通过优化引物，扩增产物长度推荐80-200bp，最好不超过300bp。

4）体系中可能存在抑制剂影响酶的活性，建议梯度稀释模板或重新制备纯度更高的模板。

 

2. 扩增曲线无法达到平台期

 

可能原因与解决方案：

基因丰度低、循环数较少，建议增加循环数或选择适合低丰度基因定量的产品。

 

3.复孔重复性差

 

可能原因与解决方案：

1）加样误差导致，建议移液器定期校准，另外可通过扩大反应体系或提前配制好预混液优化。

2）模板量低，建议提高模板量，使Ct值落在15-30之间。

3）仪器长时间未校准，建议定期进行仪器校准保养。

 

4.无扩增曲线

 

可能原因与解决方案：

1）反转录失败、cDNA 模板降解或缺失、引物降解失效、qPCR 预混液酶活性丧失，看阳性对照模板是否可以扩增，排除试剂模板问题。

2）荧光定量仪器参数设置错误，上机前对应荧光信号采集开关没有打开，未进行荧光信号搜集。建议重新实验，增加扩增程序中延伸阶段荧光信号的搜集。

 

(以ABI 7500仪器界面展示为例)

 

5.阴性对照（NTC、NRC）有扩增

注：阴性对照中，NTC（无模板对照，No Template Control）是指将H2O代替模板的阴性对照反应，NRC（No Reverse Transcription Control）是指将未反转录的RNA作为模板的阴性对照反应。

1）NTC有扩增，可能有以下两种情况：

①Ct＞35，熔解曲线Tm值＜80℃（一般正常qPCR产物，大小在100-300bp之间，熔解曲线Tm大多在80℃以上），可能是引物二聚体导致，可进一步优化引物。

 

②有Ct值且＜35，表示反应体系被污染，可逐步排除污染源。

 

2）NRC有扩增

NTC正常，NRC有Ct值，可能是RNA含有gDNA污染。建议用DNase I消化或使用含有gDNA去除的反转录试剂盒（如Yeasen Cat#11157ES）。

 

6.扩增曲线平台期下降

 

可能原因与解决方案：

基线范围设置太高，这种一般是由于模板量过高导致的。建议减小基线的终点值，可以设置为Ct值-4，调整后见下图：

 

7.扩增曲线对数图基线期异常

 

可能原因与解决方案：

基线期设置循环周期偏少造成。可以在设置中增大基线的终点值，调整后可恢复正常，调整后见下图：

 

8.扩增曲线对数图曲线分段

 

可能原因与解决方案：

基线期设置循环周期偏多造成。可以在设置中减小基线的终点值，调整后可恢复正常，调整后见下图：

 

9.扩增曲线不是标准的S型

 

可能原因与解决方案：

样本不纯，比如残留的抑制物造成的，建议通过Nanodrop测定OD260/280检测样本的纯度，也可以通过制作标准曲线确认样本质量，必要时重新制备样本。

 

10.扩增曲线平台期锯齿状

 

可能原因与解决方案：

1）RNA纯度低，建议梯度加大模板稀释倍数看优化效果或重新制备高纯度RNA重新实验。

2）仪器长时间未校准，建议定期进行仪器校准保养。

 

11.扩增曲线杂乱无规律

 

可能原因与解决方案：

ROX浓度和机型不匹配。可在仪器设置中找到Passive Reference后将ROX改为NONE，取消ROX的校正功能，查看扩增曲线是否恢复正常，即可判定是否是ROX导致的。后续可以调整ROX浓度，调整后见下图：

 

 

12.扩增曲线有向上或向下的尖峰

 

可能原因与解决方案：

仪器故障，建议维修仪器。

  

二.熔解曲线异常

熔解曲线常用来判断qPCR结果的特异性，理想的熔解曲线为单尖锐特异峰，异常的熔解曲线会出现杂峰、双峰、宽峰等可能的情况，下面我们来逐一分析。

1.熔解曲线出现双峰

1）双峰，杂峰Tm在80℃之前

 

可能原因与解决方案：

1）存在引物二聚体，建议降低引物浓度或重新设计引物等方式优化。

2）模板量过低，促使了引物二聚体的形成，建议提高模板量。

 

2）双峰，杂峰Tm在80℃以后

 

可能原因与解决方案：

1）引物特异性过差导致非特异性产物扩增，建议Blast检查引物特异性或重新设计引物。

2）gDNA污染，可通过NRC进行确认。若NRC有Ct值，可重新制备模板。

 

2.熔解曲线单峰但不尖锐

 

可能原因与解决方案：

存在大小相近的非特异性产物，建议进行高分辨率琼脂糖电泳确认。

 

3.两种试剂对比，得到的Tm值不一样

 

可能原因与解决方案：

不同试剂的促解链成分或含量不一样，导致解链温度Tm值不一样。

 

4.熔解曲线前端起杂峰

 

可能原因与解决方案：

ROX浓度和机型不匹配。可在仪器设置中找到Passive Reference后将ROX改为NONE，取消ROX的校正功能，查看熔解曲线是否恢复正常，即可判定是否是ROX导致的。后续可以调整ROX浓度，调整后见下图：

 

 

5.熔解曲线峰型杂乱

 

可能原因与解决方案：

1）反应体系污染，结合NTC和NRC结果确认污染情况，建议从水，引物，酶和环境等逐一排除污染。

2）试剂暴露在强光或高温下导致试剂失效，建议用新的试剂做对比实验。

3）仪器长时间未校准，建议定期进行仪器校准保养。

4）耗材与仪器不匹配，需确认对应仪器对耗材的要求。

 

6.熔解曲线单峰但Tm值在80℃以前

可能原因与解决方案：

可能为引物二聚体；也可能扩增片段很短导致真实产物 Tm 偏低，建议跑电泳验证扩增片段大小。

 

7.无熔解曲线

可能原因与解决方案：

1）可能扩增完全没有得到产物，通过扩增曲线有无扩增可确认。

2）可能仪器熔解程序设置错误，未搜集荧光信号，建议重新实验，增加熔解曲线阶段的信号搜集。

 

以上就是小翌为大家整理的RT-qPCR实验中可能遇到的问题及相应的建议，希望对大家有所帮助。

 

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