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        DNA 片断化检测

        最新修订时间:

        原理

        细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA 在核小体单位之间的连接处断裂, 形成50~300 kbp 长的DNA 大片段, 或180~200 bp 整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。细胞经处理后,采用常规方法分离提纯DNA,进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色,在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。如果细胞量很少,还可在分离提纯DNA 后,用32P-ATP 和脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)使DNA 标记,然后进行电泳和放射自显影,观察凋亡细胞中DNA ladder 的形成。
         

        材料与仪器

        步骤

        一、大分子染色体DNA 片段的测定

        细胞凋亡的早期,染色体断裂成为50~300 kbp 长的DNA 大片段。所有超过一定分子量大小的双链DNA 分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度相同。线性DNA 的双螺旋半径超过凝胶半径时,即达到分辨力的极限。此时凝胶不再按分子量的大小来筛分DNA,DNA 像通过弯管一样,以其一端指向电场一极而通过凝胶,这种迁移模式称之为"爬行"。因此,细胞凋亡早期产生的50~300 kbp 长的DNA 大片段不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。通常采用脉冲电泳技术可圆满地解决这一问题。这个方法是在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。每当电场方向改变后,大的DNA分子便滞流在爬行管中,直至新的电场轴向重新定向后,才能继续向前移动。DNA分子量越大,这种重排所需要的时间就越长。当DNA 分子变换方向的时间小于电脉冲周期时,DNA 就可以按其分子量大小分开。

        二、DNA Ladder 测定

         
        收获细胞(1X107)沉淀?细胞裂解液13000 rpm′5 min, 收集上清1%SDS和RnaseA(5 mg/ml)56 °C,2 h。蛋白酶K(2.5 mg/ml)37 °C,2 h,1/10 体积3 M醋酸钠和2.5倍体积的冷无水乙醇沉淀DNA,4 °C过夜。14000 rpm′15 min最后将沉淀溶解在TE buffer中,加DNA Loading Buffer 1.2 %琼脂糖凝胶电泳,EB染色并照相。
         
        三、凋亡细胞DNA 含量的流式细胞计分析
         
        收集细胞,70 %冷乙醇(in PBS)4 °C 固定过夜,PBS 洗涤,1000 rpm′10 minRNase A(0.5 mg/ml)37 °C 消化30 min PI(50 mg/ml)染色,室温避光15 min,FACScan 分析DNA 亚二倍体的形成及细胞周期的变化。
         
        四、ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH)
         
        敏感度高,适合于检测少量样本,小部分凋亡细胞。如临床活组织检测。
         

        来源:丁香实验

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