🔥 PLA 技术检测细胞中蛋白质的相互作用

PLA 技术全称为 Proximity Ligation Assay，是看得见的蛋白互作新技术，即便是微量样本、微弱或者瞬时的互作以及低丰度的表达，也能在内源水平可视化目的蛋白的互作、定位和定量。并且该技术可将蛋白信号放大千倍，灵敏度高、特异性好。不仅如此，该技术操作简单，用时短，仅需一天即可得到结果。

PLA 技术是一种特殊的免疫分析方法，首先将不同种属的两个一抗分别与目的蛋白（目的蛋白是同一个蛋白的两个区域或者两个互相结合的蛋白，下面都以两个蛋白为例）孵育，然后加入耦联了寡聚脱氧核苷酸（单链 DNA）的二抗，即 PLA probe（探针），如果目的蛋白相互作用，两个探针之间的距离就会很近，产生邻近效应。

加入与探针互补的寡聚脱氧核苷酸（杂交溶液）和连接酶，寡聚脱氧核苷酸就会形成闭环。

加入聚合酶，就能以其中一条探针作为模板，滚环复制不断形成新的闭环，这些环化 DNA 都与探针有着互补片段，聚集在探针，也就是目的蛋白在细胞中原本的位置。

最后，加入荧光素标记的寡核苷酸（检测溶液）与环化的 DNA 作用，一个环化的 DNA 可以与上百上千个荧光素标记的寡核苷酸结合，形成蛋白质的原位检测或者相互作用检测。

定位、定量、可视化检测蛋白质相互作用、检测目标蛋白。

一、细胞处理

将样品悬液滴在载玻片上，并经过 4% 多聚甲醛固定、0.2% TritonX-100（可配置 PBS + TritonX-100 溶液）透化。

二、封闭

混匀试剂盒中的封闭液，在每个 1 cm² 样品上添加 1 滴（40 μl）封闭液，确保封闭液要覆盖整个样品，将载玻片置于预热的湿盒中于 37 °C 孵箱孵育 1 小时。

三、孵育一抗

混匀试剂盒中的抗体稀释液，用抗体稀释液分别稀释两种一抗。吸干净封闭液，将一抗滴加到样品上，将载玻片置于预热的湿盒中于 37 °C 孵箱孵育 2~3 小时。

四、孵育 PLA 探针

混匀 PLUS 和 MINUS PLA 探针，按试剂盒说明书比例稀释 PLUS 和 MINUS PLA 探针，吸干净一抗溶液，在室温下用试剂盒中的 1× 洗涤缓冲液 A 洗涤载玻片 2 次，每次 5 分钟。吸干净多余的洗涤缓冲液，然后滴加 PLA 探针溶液，将载玻片置于预热的湿盒中 37 °C 孵箱孵育 1 小时。

五、连接

解冻并充分混合连接缓冲液，按说明书用纯水稀释连接缓冲液至 1×，吸干净载玻片上 PLA 探针溶液，在室温下用 1× 洗涤缓冲液 A 洗涤载玻片 2 次，每次 5 分钟。将连接酶按说明书比例添加至 1× 连接缓冲液中，并混匀。吸干净多余的洗涤缓冲液，滴加连接溶液，将载玻片置于预热的湿盒中 37 °C 孵箱孵育 30 分钟。

六、扩增

充分混合扩增缓冲液，按说明书用纯水稀释扩增缓冲液至 1×，从载玻片上吸干净连接溶液，在室温下用 1× 洗涤缓冲液 A 洗涤载玻片 2 次，每次 5 分钟。将聚合酶按说明书比例添加至 1× 扩增缓冲液中，并混匀。吸干净多余的洗涤缓冲液，然后滴加扩增溶液，将载玻片置于预热的湿盒中 37 °C 孵箱孵育 100 分钟。

七、准备成像

从载玻片上吸干净扩增溶液，在室温下用试剂盒中的另一个 1× 洗涤缓冲液 B 洗涤载玻片 2 次，每次 10 分钟。最后 0.01× 洗涤缓冲液 B 洗涤载玻片 1 分钟。

吸干净洗涤缓冲液，滴加试剂盒中含 DAPI 的封片剂，用盖玻片盖好载玻片，孵育至少 15 分钟，然后用荧光或共聚焦显微镜拍照并分析。

1. 连接酶和聚合酶要保存在 -20 °C，其他保存在 4 °C。

2. 成像以后，载玻片可在黑暗中 4 °C 保存 4 天或 -20 °C 保存 6 个月。

3. 操作过程尽量快速，不可让细胞过长时间暴露在空气中，导致细胞样本变干。