β-半乳糖苷酶活性染色方法（SA-β-gal）

衰老细胞有高活性的 β-半乳糖苷酶（β-galactosidase），通过原位染色，以 X-Gal 为底物，在β-半乳糖苷酶的催化下会生成深蓝色产物，通过光学显微镜即可观察。

组织切片染色或细胞染色，用于检测观察细胞衰老情况。

组织：

（1）需要染色的组织做冰冻切片，切片复温侯，用 PBS 轻柔洗涤 3 次，每次 5 分钟。

（2）用组化笔圈住组织，加入适当体积的染色固定液固定 30 分钟，体积以充分覆盖组织为宜。

（3）去除染色固定液，用 PBS 洗 3 次，每次 8 分钟。

（4）去除 PBS，每个组织加 30 μl SA-β-gal 染色液，最好正个切片浸泡在染色液中，可用保鲜膜封住防止蒸发，37 ℃ 孵育过夜。

（5）第二天，弃掉工作液，加封片剂封片，光学显微镜下观察拍照。

细胞：

1. 对于贴壁细胞：

（1）对于 6 孔板中培养的细胞，吸除细胞培养液，用 PBS 或 HBSS 洗涤 1 次，加入 1 ml 染色固定液，室温固定 15 分钟。

（2）吸除固定液，用 PBS 或 HBSS 洗涤细胞 3 次，每次 3 分钟。

（3）吸除 PBS 或 HBSS，每孔加入 1 毫升 SA-β-gal 染色液。

（4）37 ℃ 孵育过夜，可以用保鲜膜封住防止染色液蒸发。

（5）普通光学显微镜下观察。如不能及时观察计数，可以去除染色工作液，加入 2 ml PBS，4 ℃ 可以保存数天；或者加上封片液封片后，4 ℃ 可以保存较长时间。

2. 对于悬浮细胞：

（1）离心收集细胞至 1.5 ml 离心管内，用 PBS 或 HBSS 洗涤 1 次，加入 1 ml 染色固定液，室温固定 15 分钟。固定时可以在摇床上缓慢摇动，以避免细胞结成团块。

（2）离心，吸除细胞固定液，用 PBS 或 HBSS 洗涤细胞 3 次，每次 3 分钟。

（3）离心，吸除 PBS 或 HBSS，每管加入 0.5~1 毫升 SA-β-gal 染色液。

（4）37 ℃ 孵育过夜。

（5）取部分染色后的细胞，滴加到载玻片上或孔板内，普通光学显微镜下观察。如不能及时观察计数，可以离心，去除染色工作液，然后加入 1 ml PBS，4 ℃ 可以保存数天。如果离心，取细胞用于涂片，加上封片液封片后，4 ℃ 可以保存较长时间。

1. 孵育的持续时间取决于 β-半乳糖苷酶表达的强度。有时它需要超过 2 天的孵育时间。

2. 湿纸巾放入免疫组化避光湿盒中，避免干片。

3. 37 ℃ 孵育不能在二氧化碳培养箱中进行。

4. 孵育染色液时用保鲜膜封住湿盒防止染色液蒸发。

5. 加入染色液后，可能有结晶形成影响观察，可去除染色液后，用 70% 乙醇洗涤，待结晶溶解后换成 PBS，再观察。

6. 建议选择成熟的 β-半乳糖苷酶染色试剂盒。

拍出来的片子为什么有大量杂质？

1. 工作液需要完全融化，必要时可在 37 ℃ 烘箱中溶解，现用现配，低温会使工作液再次结晶。

2. 试剂盒可能过期变质。

3. 可用 70% 乙醇轻柔冲洗几次。