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        外泌体鉴定之 NTA:纳米颗粒跟踪分析技术

        相关实验:外泌体的提取纯化

        别名:nanoparticle tracking analysis ,NTA,外泌体鉴定,外泌体粒径分布分析

        最新修订时间:

        简介

        外泌体是直径约为 30~200 nm,密度在 1.13~1.21 g/mL 的小囊泡。外泌体天然存在于体液中,包括血液、唾液、尿液和母乳等,外泌体是活细胞分泌的来源于晚期核内体 (也称为多囊泡体 )的膜性囊泡。

        而 NTA(Nanoparticle Tracking Analysis)技术已被外泌体研究领域认可为外泌体表征手段之一。

         

        外泌体鉴定之 NTA:纳米颗粒跟踪分析技术

        原理

        其原理是对每个颗粒的布朗运动进行追踪和分析,结合 Stockes-Einstein 方程式计算出纳米颗粒的流体力学直径和浓度。相较于其他表征方式,NTA 技术的样本处理更简单、更能保证。

        用途

        表征外泌体颗粒的浓度以及粒径分布。

        材料与仪器

        材料:

        ① 外泌体

        ② DPBS(1x)

        设备耗材:

        ① 1.5 ml、5 ml EP 管

        ② 大、中枪头

        ③ 移液枪

        ④ 涡旋振荡器

        ⑤ 掌上离心机

        ⑥ 超净工作台

        ⑦ NS 300 粒度分析仪

        步骤

        1. 打开仪器电源、电脑软件,确认左下方状态框内连接正常。

        2. 将样品池洁净并安装至激光模块上,连接至电源底座上。

        3. 开软件, 点击 Start Camera,选择合适的 Screen Gain 和 Camera Level,使用 DPBS 清洗管路使摄像画面上尽量没有颗粒显示。

        4. 将提取的外泌体样本从 -80 ℃ 冰箱中取出后置放于冰盒中,融化后稍离心。从中先取 20 ul 加入到新的 1.5 ml EP 管中,再加入 980 ul DPBS 稀释 50 倍尝试,用 1 ML 注射器将稀释后的溶液上样并观察屏幕中颗粒画面,调整焦距。(如检测画面颗粒数较多时需要进行稀释检测,较少时再减少稀释倍数,一般低于 50 倍稀释仍检测效果较差,可能浓度过低)。

        5. 在 SOP 中选择所需要的测量方式,调整各项测量参数(如:测量次数、测量时间、稀释倍数等等)。

        6. 点击 Creat and Run,依照屏幕提示完成测试。

        7. 冲洗样品池,清洗管路。

        8. 清洗完毕可以继续后续样本检测,或者关闭仪器及电脑电源。

        9. 果分析及数据处理

        9-1. 每个样本每检测一次,将得到 4 个主要文件,主要包括:「.avi」(记录颗粒的布朗运动状态)「.pdf」(机器检测报告 PDF 文档)「.csv」(记录检测过程中仪器的温度等参数,以及原始数据) 「.nano」(原始文件,可用 NanoSight NTA 3.4 软件打开)。

        9-2. 每个样本将连续采集 3 次测试结果,会有3组数据。

        9-3. 如需重新绘制粒径与浓度分布图,可在「.csv」文件中,选择 Bin centre (nm)、Concentration (particles / ml)列数据,利用 Origin、Graph Pad 等软件作图,所得图像与报告基本一致。

        注意事项

        注:稀释倍数需根据最后结果得出的颗粒数而定(颗粒数在 20~100 之间即可)

        常见问题

        报告提示结果不可信或噪音污染: 

        1. 软件分析时,调整合适阈值(一般每帧图片不超过3个蓝色标记的颗粒),降低噪音污染。

        2. 颗粒浓度过低,无法测量到准确数值。

        3. 整合适的稀释倍数,如画面中颗粒过多可能导致浓度不准、或有散射光较强的颗粒过多可能会造成明显的噪音污染影响结果 。

        来源:丁香实验

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