外泌体纯化和分析之磁珠分选法

CD63 外囊泡阳性分选试剂盒，设计通过免疫磁珠正选方式从血浆/血清、培养上清物中分离高纯度的人外囊泡。

外囊泡被识别 CD63 四聚体抗体复合物和磁珠标记。被标记的外囊泡被吸附在管壁上，未经标记的组分被倒入新的离心管。

分离到的外囊泡可用于下游应用，如DNA/RNA提取，WB或质谱分析。

富集外泌体颗粒

【样本制备】

一、血浆样本的制备

1. 静脉采血（尽量用大针头，减少对血液细胞的破坏，污染外泌体），废弃最初的1-2ml血液；

2. 用柠檬酸盐抗凝管收集血液；建议用医用EDTA抗凝管收集，并轻柔充分混匀（ 30min 内做后续处理样本）

3. 800×g离心 10min，去除红细胞和白细胞；

4. 收集血清，2500×g 离心 10min，充分去除血浆中的杂质和细胞碎片等；（建议取血浆）

5. 收集血清（主要含血浆和血小板），-80℃ 保存；（收集血浆）

6. 干冰运输。

二、尿液样本的制备（以 50ml 收集管为例）

1. 在50ml尿液收集管中加入0.4ml 2%的硫柳汞抑菌剂，收集中间尿≥40ml（中间尿含细胞和蛋白较少），此时硫柳汞达到工作浓度0.02%；（比例1:100或1:200 2%硫柳汞）

2. 尿液保存于-80℃，干冰运输。

三、细胞培养上清的制备：

1. 细胞常规培养，当细胞密度达到约70%后，进行换液，换液时培养基更换为无外泌体的FBS完全培养基（根据实验要求确定FBS含量）。培养24h后，收集培养上清；

2. 于超净台中将细胞培养上清液样本分装于15mL的离心管中，配平后室温、300×g离心10min，收集上清液（去除死细胞和大的细胞碎片）；

3. 收集的上清液分装于15ml的离心管中，配平后室温、2000×g离心10min，收集上清液（去除较大的颗粒）；2500g

4. 上清储存于-80℃，干冰运输。
特别注意：收集细胞培养上清之前24小时，务必换成无外泌体FBS的完全培养基。

【实验步骤】

1. 将样本 10000-12000g，4℃ 离心 30 min，取上清；

2. 根据使用说明，加入适量的样本。向样本中添加试剂，混匀孵育（不能涡旋）；

3. 涡旋磁珠，添加至样本中，混匀孵育；

4. 向样本中补满推荐的培养基至标示体积，上下轻轻吹吸3次；

5. 将板子放入磁场孵育；

6. 仔细吸弃上清，不能倾倒，，不能将板子移出磁场；

7. 向样本中补满推荐的DPBS至标示体积，上下轻轻吹吸3次；

8. 孵育；

9. 重复步骤7-8两次；

10. 去除上清，将板子移出磁场，用合适的液体重悬沉淀即可。

1. 请严格进行样本前处理，否则会影响外泌体分离质量;

2. 注意使用说明中的注意点，如：试剂的混匀的力度、磁场的维持等等。

1. 试剂盒分离的外泌体往往纯度较低，夹杂较多杂质，可能会影响测序结果；

2. 不推荐此方法分离的外泌体直接用来进行细胞功能学实验和动物实验，建议纯化后使用；

3. 本方法不适用大规模分离。