酶联免疫吸附法测定植物激素含量

植物的生长发育、基因表达以及对环境刺激的反应均受体内激素平衡的制约。但是，由于内源激素含量极低，在实验室中要精确快速测定是比较困难的。植物激素(planl hormone)的免疫法测定极大地促进了植物激素的研究。

本实验的目的是掌握酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定植物激素含量的原理及操作，熟悉酶联免疫检测仪的使用。

1. 在ELISA中，抗原抗体反应的检测依靠酶标记物来实现，常用的酶有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酯酶。酶可直接标记激素分子，称为酶标植物激素，也可标记于第二抗体 (识别抗激素抗体Fc片段的抗体或金黄色葡萄球菌A蛋白)，称为酶标二抗。这两类标记物分别用于固相抗体型和固相抗原型ELISA。

（1) 固相抗体型ELISA：将抗激素的单克隆抗体(MAb)与已吸附于固相载体上的兔抗鼠1 g抗体(RAMIG)结合，然后加入激素标准品或待测样品,使其与固相化的MAb结合，再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记激素(酶标激素)。通过测定酶标激素的被结合量，可换算出未知样品中激素的数量。

(2) 固相抗原型ELISA：将“激素-蛋白”复合物(该蛋白应不同于免疫原中的载体蛋白)包被于固相载体，加入待测激素(样品或标准品)和抗IAA多克隆抗体(PAb)反应，进行竞争反应，然后让HRP标记羊抗兔Ig抗体(HRP-GARIG)与结合在固相上的PAb反应，通过测定与固相结合的酶量，换算出未知样品中激素的含量。

酶联免疫吸附法测定植物激素含量的基本过程可分为如下几步：

（一） 固相抗体型ELISA

1. 用方阵法滴定选择各反应物最适工作浓度。

2. 将100 μL RAMIG溶液包被聚苯乙烯反应板微孔4 °C湿盒，12 h_。

3. 弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗涤3次，甩干。

4. 加入100 μl 抗激素 MAb 溶液,37 °C，70 min。

5. 弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗涤3次，甩干。

6. 各孔内依次加入50 μL待测样液，每个样品3次重复，15~20 °C，20 min_。

7. 加入50 μL HRP标记激素，37 °C ，60 min。

8. 弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗涤3次,甩干。

9. 加入 100 μL OPD 基质液，37 °C显色 15~20 min,加入 50 μL 3mol · L ^-1 H₂SO₄，溶液 终止反应。用酶联免疫检测仪测定490 nm下各孔的A₄₉₀值，求出每份样品重复孔的平均值。

10. 用激素标准品母液和参比系列溶液.在同一微孔板上同上法操作。

（二） 固相抗原型ELISA

1. 用方阵法滴定选择各反应物最适工作浓度。

2. 将100 "激素-蛋白" 复合物溶液包被于微孔板，37 °C,12 h。

3. 弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗涤3次，甩干。

4. 加入100 μL 1% 封闭蛋白溶液封闭,37 °C,30 min。

5. 弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗涤3次，甩干。

6. 各孔同时加入50 μL样液和50 μL抗激素PAb溶液，以加入正常兔血清溶液的孔（非特异吸附孔）为空白调零，37 °C,60 min。

7. 弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗涤3次，甩干。

8. 加入 100 μL HRP-GARIG 溶液,37 °C，60 min。

9. 弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗涤3次，甩干。

10. 随后的显色、中止与比色程序同上。

11. 用激素标准品母液和参比系列溶液，在同一微孔板上同上法操作。

（三） 结果计算

1. 因相抗体型ELISA。

（1) 以加入激素母液的孔（非特异吸附孔）为空白调零，以加入不含激素的PBS的孔为B₀

孔，以加入激素标准参比系列溶液的各孔为 B_i 孔。以标准激素物质的量的常用对数lg n为横坐标（x），对应的 ln [B_j/（B_o - B_j）] 为纵坐标（y），可得一条直线y =a +bx。

（2) 将样品孔的人倾值代入上式，换算出待测样品中激素的物质的量，乘以稀释倍数，除 以样品重量，即为每克样品的激素含量。

2. 固相抗原型ELISA_。

以加入不含激素的磷酸缓冲液的孔为B_o孔，以加入激素标准参比系列溶液的各孔为B_j孔，标准曲线计算与结果分析同上。

1. 注意: 酶联免疫检测仪的原理及使用方法。

2. 必须了解所采用抗体的特异性，未经过严格交叉反应试验的抗体不能用于免疫检测，否则会导致错误的结果。