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        TSHR 活化的脾细胞免疫建立 Graves 眼病的动物模型

        相关实验:甲状腺相关眼病动物模型

        最新修订时间:

        简介

        (1) 质粒抽提及定量:大量扩增宿主菌 E.coli DH5α,用质粒抽提试剂盒提取足量质粒 DNA,经紫外分光光度计纯度鉴定及定量后,用磷酸盐缓冲液调整为 100 μg/200 ul。

        (2) 基因免疫:免疫前 5 天行预处理,在小鼠胫前肌分 3 点注射 PBS 液 100 μl,然后在小鼠胫前肌相应部位分别注射 100 μg 重组质粒 pcDNA311/hTSHR,免疫后第 3、6 周加强免疫两次。18 周后处死所有小鼠。

        (3) 分离牌细胞:基因免疫后 18 周,所有小鼠分别用颈椎脱臼法处死,75% 乙醇消毒皮毛。无菌取出脾脏,用 RPMI 1640 液冲洗,摘除脂肪及其他结缔组织。将脾脏剪碎、匀浆、过滤,制成脾细胞悬液,调整细胞浓度为 106/100 ul。

        (4) 脾细胞转移:在小鼠尾静脉注人活化脾细胞,脾细胞注射量均为 106。4 周后处死所有小鼠。

        观察指标:摘取甲状腺和眼眶组织进行病理学组织检查,甲状腺和眼眶组织分别采用冷冻以及石蜡切片,并检测相关指标。所有采出的血液用 ELISA 法检测血清指标检测。

        原理

        在前述模型的基础上,从脾脏取出活化的免疫细胞,再次进行免疫注射造模,其免疫特征呈放大效应。

        用途

        由于该模型涉及了体液和细胞免疫,因此在免疫机制研究中有明显优势。

        材料与仪器

        实验动物:

        采用 6~8 周龄的雌性 BALB/c 小鼠。

        实验仪器:

        ① 质粒抽提试剂盒;

        ② 总甲状腺素(totalltraiodohyronine, TT4)放射免疫试剂盒;

        ③ 促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone, TSH)免疫放射试剂盒;

        ④ 促甲状腺激素受体抗体(TSH receptor antibody, TRAb)酶联免疫吸附法试剂盒。

        实验试剂:

        ① 质粒 pcDNA311;

        ② 重组质粒 peDNA311/hTSHR;

        ③ DH5α 宿主菌;

        ④ 淋巴细胞分离液。

        步骤

        TSHR 活化的脾细胞免疫建立 Graves 眼病的动物模型的基本过程可分为如下几步:

        A. 质粒抽提及定量:


        大量扩增宿主菌 E.coli DH5α,用质粒抽提试剂盒提取足量质粒 DNA,经紫外分光光度计纯度鉴定及定量后,用磷酸盐缓冲液调整为 100 μg/200 ul。

        B. 基因免疫:


        免疫前 5 天行预处理,在小鼠胫前肌分 3 点注射 PBS 液 100 μl,然后在小鼠胫前肌相应部位分别注射 100 μg 重组质粒 pcDNA311/hTSHR,免疫后第 3、6 周加强免疫两次。18 周后处死所有小鼠。

        C. 分离牌细胞:


        基因免疫后 18 周,所有小鼠分别用颈椎脱臼法处死,75% 乙醇消毒皮毛。无菌取出脾脏,用 RPMI 1640 液冲洗,摘除脂肪及其他结缔组织。将脾脏剪碎、匀浆、过滤,制成脾细胞悬液,调整细胞浓度为 106/100 ul。

        D. 脾细胞转移:


        在小鼠尾静脉注人活化脾细胞,脾细胞注射量均为 106。4 周后处死所有小鼠。

        观察指标:


        摘取甲状腺和眼眶组织进行病理学组织检查,甲状腺和眼眶组织分别采用冷冻以及石蜡切片,并检测相关指标。所有采出的血液用 ELISA 法检测血清指标检测。

        注意事项

        该模型最大限度地模拟了人 TAO 的病理机制。甲状腺相关眼病的免疫应答过程包括细胞免疫和体液免疫,以前普遍认为其为抗体介导的免疫应答反应,免疫反应类型以 Th2 型反应为主。

        但随着动物模型研究的深入,人们开始质疑这种说法。首先,人们发现不同遗传背景的鼠种会出现不同类型的免疫反应。用不同细胞作为抗原呈递细胞反应类型也不同,用成纤维细胞诱导动物模型时就以 Th2 型反应为主,而以脾细胞诱导时则以 Th1 型反应为主。

        来源:丁香实验

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