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        TSHR 基因转染的腺病毒免疫建立 Graves 眼病的动物模型

        相关实验:甲状腺相关眼病动物模型

        最新修订时间:

        简介

        (1) 利用含 TSHR 的 A 亚单位的穿梭质粒构建腺病毒表达的 TSHR 的 A 亚单位。穿梭质粒 pHMCMVTSHR289 用常规 CaCl2 法转化 DH5ax 大肠埃希菌感受态细胞。

        (2) 重组质粒 pAdHM4CMVTSHR 构建:

        穿梭质粒 pHMCMVTSHR 和骨架质粒 pAdHM4 均由酶 I-Ceu/PI-Sce 双酶切后,转入 E.coli BJ5183 中, 使两者在其中重组。挑选、抽提质粒,得到腺病毒重组质粒 pAdHM4CMVTSHR289,用酶切鉴定。

        (3) 重组腺病毒的包装、扩增及纯化:

        腺病毒重组质粒 pAdHM4CMVTSHR289 经 Pac I 酶切后, 用凝胶回收试剂盒纯化线性化 pAdHM4CMVTSHR289。准备 293E 细胞,行感染扩增重组病毒,并行鉴定。

        (4) 甲状腺相关眼病动物模型的构建:

        实验动物采用同系 6-8 周大小雌性 BALB/c 小鼠,将 undefined10II AdCMVTSHR289 抗原颗粒溶于 50 μl 的 PBS 液中,分别于 0、3、6、9 周行 BALB/c 小鼠胫前肌内注射,所有小鼠在免疫前及每一次免疫后 2 周从尾静脉采血。

        观察指标:

        16 周时处死 BALB/c 小鼠,从心脏取血,同时摘取甲状腺和眼眶组织进行病理学组织检查,甲状腺和眼眶组织分别采用冷冻以及石蜡切片,并检测相关指标。所有采出的血液用 ELISA 法检测血清指标检测。

        原理

        以腺病毒为载体,将 TSHR 基因转染到小鼠体内,造成自身免疫反应,导致眼眶和甲状腺病变。

        用途

        在所有的模型中,采用含有 TSHR 基因的质粒转染的腺病毒免疫鼠的成模率最高,应用最为广泛。

        材料与仪器

        实验器材:

        小量抽提试剂盒与凝胶回收试剂盒。

        实验试剂:

        ① 含 TSHR 的 A 亚单位的穿梭质粒 pHMCMVTSHR289;

        ② 骨架质粒 pAdHM4;

        ③ 293 E 细胞;

        ④ DH5α 感受态细菌;

        ⑤ coli BJ5183 电感受态菌;

        ⑥ 酶 I-Ceu,PI-Sce I,Pac I。

        步骤

        TSHR 基因转染的腺病毒免疫建立 Graves 眼病的动物模型的基本过程可分为如下几步:

        A. 利用含 TSHR 的 A 亚单位的穿梭质粒构建腺病毒表达的 TSHR 的 A 亚单位。穿梭质粒 pHMCMVTSHR289 用常规 CaCl2 法转化 DH5ax 大肠埃希菌感受态细胞。

        B. 重组质粒 pAdHM4CMVTSHR 构建:

        穿梭质粒 pHMCMVTSHR 和骨架质粒 pAdHM4 均由酶 I-Ceu/PI-Sce 双酶切后,转入 E.coli BJ5183 中,使两者在其中重组。挑选、抽提质粒,得到腺病毒重组质粒 pAdHM4 CMVTSHR289,用酶切鉴定。

        C. 重组腺病毒的包装、扩增及纯化:

        腺病毒重组质粒 pAdHM4CMVTSHR289 经 Pac I 酶切后,用凝胶回收试剂盒纯化线性化 pAdHM4CMVTSHR289。准备 293E 细胞,行感染扩增重组病毒,并行鉴定。

        D. 甲状腺相关眼病动物模型的构建:

        实验动物采用同系 6-8 周大小雌性 BALB/c 小鼠,将 undefined10II AdCMVTSHR289 抗原颗粒溶于 50 μl 的 PBS 液中,分别于 0、3、6、9 周行 BALB/c 小鼠胫前肌内注射,所有小鼠在免疫前及每一次免疫后 2 周从尾静脉采血。

        观察指标:

        16 周时处死 BALB/c 小鼠,从心脏取血,同时摘取甲状腺和眼眶组织进行病理学组织检查,甲状腺和眼眶组织分别采用冷冻以及石蜡切片,并检测相关指标。所有采出的血液用 ELISA 法检测血清指标检测。

        注意事项

        雌性动物发病率比雄性动物明显高,与人类 TAO 类似;模型的眼眶病理改变和人类似,同时也可以检测出激素水平及自身抗体的抗体。

        来源:丁香实验

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