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        HK1 活性测定

        相关实验:无氧氧化途径中关键酶和重要产物测定

        最新修订时间:

        简介

        测定己糖激酶活性对于了解细胞糖代谢的状态具有重要意义。 HK 是葡萄糖分解代谢途径中的第一个关键酶,催化葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸。HK 共有 4 种同工酶,目前的研究主要集中于 HK I 和 HK II。葡萄糖-6-磷酸是糖酵解、磷酸戊糖途径、糖原合成和糖异生等代谢过程的交叉点。

        原理

        HK1 活性测定的基本原理是葡萄糖和 ATP 在 HK 催化下生成葡萄糖-6-磷酸和 ADP;在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)催化下和存在氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)时,生成葡萄糖-6-磷酸内酯和还原型 NADP(NADPH)。在 NADP 充足的条件下,NADPH 的含量变化与葡萄糖-6-磷酸含量变化成正比。由于 NADPH 在 340nm 处有最大吸收峰,检测 NADPH 的吸光度变化可反映出 HK 的活性。

        材料与仪器

        1、细胞样品或组织样品

        2、细胞裂解液

        3、生理盐水

        步骤

        HK1 活性测定的基本过程可分为如下几步:

        ① 细胞样品:收集细胞到离心管内,弃上清,按照每 10° 个细胞加入 200 μl 细胞裂解液,充分匀浆,8000 g 离心 10 分钟,取上清,置冰上待测;


        ② 组织样品:按每 10 mg 组织加入 100 μl 生理盐水的比例进行匀浆,4 ℃、8000 g 离心 10 分钟,取上清,置冰上待测;


        ③ 血清(浆)样品可直接进行检测。所有样品均应避免反复冻融而影响酶的活性。

        注意事项

        ① 不同细胞、组织的 HK 活性差异较大,需进行预实验确定测量参数和样品稀释程度;


        ② NADPH 的分析受温度影响较大,检测反应液的温度必须保持 37 ℃ 恒温;


        ③ 某些试剂需要低温保存,避免变性和失活。

        来源:丁香实验

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