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        PPO活性测定

        互联网

        12108

        一、原理与方法

        PPO催化各种酚与O2氧化为醌。本实验是采用邻苯二酚为底物,在0.2M磷酸氢二钠-0.1M柠檬酸缓冲液PH5.8的反应体系中,PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌,在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化,通过OD值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。

        其方法是:在含有4mlPH5.8的0.2M磷酸氢二钠-0.1M柠檬酸缓冲液试管中加入0.05ml0.05M邻苯二酚溶液,在30℃恒温水浴中预热后加入0.05ml酶液,反应5分钟,在分光光度计410nm处读取吸光值。在上述条件下,以A410读数,以每分钟增加0.01O.D.值定义为一个酶活性单位(U)。

        二、仪器与试剂

        (1)样品:

        多酚氧化酶粗酶液

        硫酸铵沉淀组分

        DE-52洗脱组分

        葡聚糖凝胶洗脱组分

        (2)底物:

        邻苯二酚:O.01M邻苯二酚溶液

        (3)反应体系:

        0.2M邻酸二氢钠-0.1M柠檬酸缓冲液PH5.8

        (4)器皿与仪器:

        试管、恒温水浴等

        分光光度计

        三、酶蛋白的比活性

        比活性=酶活单位(U)/mg蛋白质

        四、实验结果与分析

        1. Sephadex G-200的洗脱组分的相对浓度(OD590)和相对酶活(OD410)

        结果列表

        试管号 蛋白质浓度 PPO酶活 试管号 蛋白质浓度 PPO酶活

        空白 0 0 3 0.16 0.09

        粗酶液 0.20 0.14 4 0.03 0.03

        1 0.00 0.01 5 0.03 0.01

        2 0.13 0.09 6 0.02 0.02

        分析:2和3试管中含绝大部分所需蛋白,保存进行下一步纯化。

        2. DE-52的洗脱组分的相对浓度(OD590)和相对酶活(OD410)

        结果列表

        试管号 蛋白质浓度 PPO酶活 试管号 蛋白质浓度 PPO酶活

        空白 0 0 3 0.03 0.05

        粗酶液 0.22 0.16 4 0.09 0.05

        1 0.00 0.00 5 0.07 0.02

        2 0.03 0.02 6 0.03 0.00

        分析:酶活性高低不一定与蛋白含量高低成正比,3和4试管中含较多所需蛋白

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