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        基于原位杂交法检测miRNA

        相关实验:长链非编码RNA的研究策略及技术

        别名:fluorescence in situ hybridization,FISH

        最新修订时间:

        简介

        荧光原位杂交原位杂交是以已知序列核酸作为特异性探针与细菌、细胞或组织切片中的核酸进行杂交并对其进行检测的一种方法。

        原理

        基于原位杂交法检测miRNA的基本原理是如果被检测的染色体或DNA显微切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的,两者经变性退火复性,即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。


        将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子生物素(或地高辛),可利用该报告分与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应,经荧光检测体系在显微镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。

        用途

        荧光原位杂交是一种重要的非放射性原位杂交技术,对于研究细胞的生物学功能、基因表达的规律以及病原微生物的检测等,都有着重要意义。

        材料与仪器

        器材:


        摇床、显微镜。


        试剂:


        ①二甲苯;
        ②乙醇;
        ③HCI;
        ④乙酸酐/三乙醇胺;
        ⑤杂交缓冲液;
        ⑥甲醛;
        ⑦SSC;
        ⑧染色溶液;
        ⑨核固红。

        步骤

        基于原位杂交法检测miRNA的基本过程可分为如下几步:


        A. 取石蜡包埋组织,切取5µm厚度切片包被在载玻片。


        B. 将载玻片放在二甲苯中去石蜡,50 r/min振荡10 min后,换一次二甲苯再以同样转速振荡10 min,接着依次用100% 、95% 、80% 、75% 的乙醇清洗各5 min,最后用去离子水冼2次。


        C. 将载玻片浸没在0.2 mol/L HCI溶液中5 min,在25 °C用PBS(含蛋白酶K 40 µg/ml)消化20 min,再转移至PBS(含0.2% 甘氨酸)中漂洗,在含4% 多聚甲醛的PBS(pH7.4)中固定10 min。


        D. 将载玻片用PBS漂洗2次之后,用乙酸酐/三乙醇胺(6.25 µl乙酸酐,5.2 µl 12 mol/L HCI,14 µl三乙醇胺,H2O补至1 ml)浸泡10 min,PBS漂洗4次,每次5 min。


        E. 49.5 ℃在杂交缓冲液中预杂交2 h。


        F. 在预热的100 ml杂交缓冲液中加入2 µl(终浓度5 pmol/L)探针,将载玻片放于其中,49.5 ℃过夜。


        G. 切片用5xSSC洗涤2次,再接着用50% 甲醛/2xSSC在50 ℃洗涤3次,每次20 min。


        H. 用TBST漂洗5次,然后将组织切片放于封闭液中,4 ℃封闭16 h。


        I. 载玻片用TBST洗4次,每次10 min,杂交液洗2次,每次10 min。接着在暗室中加上商品化染色溶液(1 ml染色溶液,2.4 µl 100 mg/ml四氯唑蓝,3.5 µl 50 mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸,1 nm 10l/L左旋咪唑),孵育4~48 h,对组织也需要进行同样的探针染色。


        J. 当达到期望的亮度时,将载玻片转移至终止液,终止反应。


        K. 用核固红套染2~3 min,用水溶性封片剂封片,显微镜下观察杂交情况,拍照。

        来源:丁香实验

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