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        基于实时定量PCR分析lncRNA

        相关实验:长链非编码RNA的研究策略及技术

        最新修订时间:

        简介

        实时定量PCR依靠荧光标记物和自动化仪器,每次循环都可读出荧光强度,实时监测了反应进程中的PCR产物,从而更精确地实现了对模板样品的定量及定性的分析。

        原理

        基于实时定量PCR分析lncRNA的基本原理是指实时定量PCR的基础在于反应起始的模板DNA量与循环过程的指数期的扩增产物量之间存在着定量关系,利用荧光信号的实时监测和计算,可以反映出这种定量关系。


        在PCR反应早期,产生荧光的水平不能与背景明显地区别,而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期,因此可以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量,并且由此来推断模板的初始含量。

        用途


        实时定量PCR技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。

        材料与仪器

        器材:


        研磨仪、PCR仪。


        试剂:


        ①TRIzol;
        ②异丙醇 ;
        ③75% 乙醇;
        ④Oligo(dT)18(0.1 µg/µl);
        ⑤10 mmol/L dNTP;
        ⑥5×M-MLV;
        ⑦核酸酶抑制剂(25 U/µl);
        ⑧M-MLV反转录酶(100 U/µl);
        ⑨10×PCR反应缓冲液;
        ⑩Taq酶(5 U/µI)。

        步骤

        基于实时定量PCR分析lncRNA的基本过程可分为如下几步:


        (一)引物和探针的设计


        检查比对序列,先选择好探针的位置,然后设计引物使其尽可能地靠近探针。探针的设计原则是:


        ①尽可能短,不要超过30 bp;;②Tm值应在68-70 ℃之间;③避免5'-端是鸟苷酸(G),以免发生淬灭作用;④选择胞苷酸(C)多于鸟苷酸(G)的链作探针,G的含量多于C会降低反应效率。


        (二)动物组织/细胞总RNA的抽提及检测(TRIzol法)


        A. 取新鲜动物组织0.1~0.2 g置于研钵中,用剪刀剪碎组织,研钵中加入少量液氮,迅速研磨,待组织变软,再加少量液氮,再研磨,成粉末状,每100 mg组织加入1 ml TRIzol,在冰浴中迅速匀浆15~30 s,以充分研碎组织。然后将细胞悬浮液吸入另一微量离心管中,室温下静置5 min。


        B. 若为贴壁细胞,培养预定时间后,彻底弃掉培养液。将TRIzol试剂直接加在贴壁细胞上,室温放置10 min;若为悬浮培养细胞,则直接离心收集细胞后用TRIzol重悬、裂解,每1 ml TRlzol可裂解5x106个动物、植物或酵母细胞,或1X107个细菌菌体。


        C. 反复吹打裂解组织/细胞,裂解液移入新管,室温静置5 min,4 ℃、12000 g离心10 min。


        D. 将上清转移入新管,按照TRIzol:氯仿等于5:1的比例加入氯仿200 µl,用力颠倒充分混匀,静置10 min,待其分层后,4 °C、12000 g离心15 min。


        E小心转移水相至新管中,加入等体积异丙醇,振荡混匀,室温放置10 min,4 ℃、12000 g离心10 min,小心弃上清。


        F. 向沉淀中加入75% 乙醇,振荡片刻,以4 °C、7500 g离心5 min,小心弃上清。室温静置5~15 min,使RNA沉淀恰好干燥,以DEPC水溶解,保存于-70 ℃冰箱中备用。

        注意事项:


        RT-PCR实验的成败在很大程度上取决于RNA的纯度和完整性。利用动物组织/细胞提取RNA时,要利用高浓度的蛋白质变性剂以及酚、氯仿等有机溶剂处理、离心,使RNA与其他细胞组分分离。


        在提取的过程中要抑制内源和外源的RNA酶(RNase)活性,保护RNA分子不被降解。因此提取必须在无RNase的环境中进行,配制RNA提取试剂要用焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate,DEPC)处理过的水以去除残余的RNA酶。


        (三)RT-PCR反应


        A. 反转录


        在微量离心管中加入模板RNA 2 µg,Oligo(dT)18(0.1µg/µl)5 µl,10 mmol/L dNTP 2µl,DEPC水补足体积至14 µI,65 °C水浴5 min,立即放到冰上,顺序依次加入:


        5×M-MLV反应缓冲液 4µI
        核酸酶抑制剂(25 U/µl) 1µI
        M-MLV反转录酶(100 U/µl) 1µI

        37 ℃孵育60 min。


        B. PCR反应


        反转录产物(模板) 2 µI
        10×PCR反应缓冲液 5 µI
        10 mol/L dNTP 4 µI
        引物(50 µmol/L) 1 µI
        Taq酶(5 U/µI) 0.5 µI

        DEPC水 37.5 µI


        扩增程序:


        94 ℃ 5 min热启动;94 °C 45 s,57 ℃ 30 s

        72 ℃ 1 min,30个循环;72 °C10 min。


        注意事项:


        RT-PCR中的关键步骤是RNA的反转录,然后核糖核酸酶H(RNaseH)催化DNA-RNA杂合体的RNA部分降解。未除净的蛋白质可与RNA结合从而影响反转录和PCR反应。若RNA模板中污染了微量DNA,扩增后会出现非特异DNA的PCR产物。


        (四)PCR数据分析


        一般而言,荧光扩增曲线可以分成3个阶段:荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期,其形状是一条平滑的"S"形曲线。


        1. 标准曲线法的绝对定量 用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线。标准品可以是纯化的质粒DNA,体外转录的RNA,或者是体外合成的单链DNA。


        2. 标准曲线法的相对定量 属于自身相对标准曲线。所用的标准品只要知道其相对稀释度即可。在整个实验中样品靶序列的量来自于自身标准曲线,最终必须除以参照物的量。


        3. Ct比较法的相对定量运用数学公式[ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct内参基因)实验组-(Ct目的基因-Ct内参基因)对照]来计算相对量,Ct是热循环仪检测到达设定的阈值荧光信号时所经历的循环数。


        假设每个循环增加1倍的产物数量,在PCR反应的指数期得到的Ct值反映起始模板的量,一个循环的不同相当于起始模板数2倍的差异(2-ΔΔCt)。


        所以,2-ΔΔCt表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数。该方法不必制作标准曲线,但前提是目的基因与内参基因要有类似的扩增效率。

        注意事项

        常见问题 1


        问题表现:影响特异性的因素


        可能原因1:由于引物或探针降解、引物或探针设计不合理而造成的Ct值出现过晚或无Ct信号出现。
        解决方案1:设计更好的引物或探针;优化引物浓度和退火温度。避免引物或探针降解可在进行实时定量PCR实验前通过电泳检测其完整性。

        可能原因 2:模板有基因组的污染而出现非特异扩增
        解决方案 2:在RNA提取过程中避免DNA的污染,或通过引物设计避免非特异扩增。

        常见问题 2


        问题表现:影响重复性的因素


        可能原因 1:目的基因的初始拷贝数较低,造成结果的重复性较差。
        解决方案 1:应使用初始浓度较高的样品或减少样品的稀释倍数。

        常见问题 3


        问题表现:标准曲线的线性关系不佳


        可能原因 1:加样不准,使得标准品不呈梯度。

        解决方案 1:减小加样误差


        可能原因 2:标准品出现降解。

        解决方案 2:妥善保存标准品,防止降解。


        可能原因 3:模板浓度过高。
        解决方案 3:在制作标准曲线时,应至少选择5个稀释度的标准品,涵盖待测样品中目的基因量可能出现的全部浓度范围。

        常见问题 4


        问题表现:影响敏感度高低的因素


        可能原因 1:特异性产物与引物二聚体竞争荧光染料SYBR Green, 从而降低了实时PCR的敏感性。


        解决方案 1: 用TaqMan探针代替SYBR Green。

        解决方案 2: 使用热启动方法加强特异性。

        解决方案 3: 要尽可能地优化引物设计。使两条引物的GC含量大致一致,使用纯化的引物进行实验等都有助于防止引物二聚体形成。


        可能原因 2:Mg2+的浓度


        解决方案 2: 一般来说,对以DNA或cDNA为模板的PCR反应,应选择2-5 mmol/L浓度的MgCl2;对以mRNA为模板的RT-PCR而言,则应选择4-8 mmol/L浓度的MgCI2

        来源:丁香实验

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