51Cr 释放法检测人抗原特异性细胞毒性 T 细胞功能

⁵¹Cr 释放法检测人抗原特异性细胞毒性 T 细胞功能的基本过程可分为如下几步:

（一）人特异性 CTL 的诱导和制备

A. 效应细胞: 取 HLA-A2 阳性个体外周血 PBL，无血清 RPMI 1640 洗两遍，用含 20％ 的新生牛血清的 RPMI 1640 调成 1.5x10⁶/ml，置于 24 孔板中，于 5％ CO₂ 培养箱中 4 小时使单核细胞贴壁以去除之，然后收集细胞，计数。

B. 刺激细胞: 取 HLA-A2 限制性的 EB 病毒来源的抗原肽（例如 LMP2A426-434）40 μg/ml 与 T2 细胞 37℃ 孵育 3 小时。无血清 RPMI 1640 液 1000 r/min 离心 6 分钟洗涤后加入丝裂霉素 C，最终浓度为 30 μg/ml，于 37℃ 水浴中作用 30 分钟，1000 r/min 离心 6 分钟，弃上清，沉淀细胞用 RPMI 1640 液洗涤 3 次并计数。

C. 特异性 CTL 的诱导: 取已除去单核细胞的 5x10⁶ PBL 于 24 孔板中，与经上述处理的 T2 细胞 2x10⁵（25:1）作为刺激细胞，混匀，用完全培养基（RPMI 1640）补总体积至 1 ml。静置于培养箱中，4 天后半量换液，继续培养 3 天。第 2 周起，PBL 与 T2 比例为 10:1。每周加刺激细胞一次，共刺激 3 次。其中在第 2 次刺激的第 3 天加入 IL-2（终浓度 20U/ml），并每隔 3-4 天更换一次培养基。在第 3 次刺激结束后，离心收集细胞，即特异性 CTL。

（二）靶细胞的制备 靶细胞为加载相应抗原肽的 T2 细胞。

A. T2 细胞加载抗原肽（LMP2A426-434）: 取 1x10⁶-2x10⁶ T2 细胞与 40 μg/ml 抗原肽 37℃ 共孵育 3 小时。无血清 RPMI 1640 液 1000 r/min 离心 6 分钟洗涤。

B. 丝裂霉素 C 灭活 T2 细胞: 无血清 RPMI 1640 液重悬 T2 细胞，加入丝裂霉素 C，最终浓度为 30 μg/ml，于 37℃ 水浴中作用 30 分钟。1000 r/min 离心 6 分钟，弃上清，沉淀细胞用 RPMI 1640 液洗涤 3 次并计数。

C. ⁵¹Cr 标记 T2 细胞: 无血清 RPMI 1640 液重悬 T2 细胞，2x10⁶/0.5 ml，加入 100-200μ Ci⁵¹Cr，置 37℃ 水浴 90 分钟，每间隔 15 分钟振摇一次。用含 5％ NCS 的 RPMI 1640 培养液洗涤三次，除去游离的 ⁵¹Cr。计数活细胞，用完全 RPMI 1640 培养液调整细胞浓度至 1x10⁵/ml。

（三）效-靶细胞作用

在无菌操作条件下，取效应细胞和靶细胞各 0.1 ml（E/T＝25:1 和 50:1），加入 96 孔培养板内，每份标本做 3 复孔。同时设自然释放对照孔（0.1 ml 靶细胞＋0.1 ml 完全 RPMI1640 培养液）和最大释放孔（0.1 ml 靶细胞＋0.1 ml 2％ SDS），放置 37℃、5％ CO₂ 温箱内孵育 4 小时，取出后用微量移液器吸出各孔上清 0.1 ml，加于小塑料试管内（勿将细胞吸出），用 γ 计数仪测量 cpm 值。

（四）结果计算