LDH 法检测人外周血 CTL 细胞杀伤活性

相关实验：细胞毒实验技术

最新修订时间：2022-02-10

简介

LDH 法检测人外周血 CTL 细胞杀伤活性，常用来测得 NK 细胞的杀伤活性。

原理

LDH 法检测人外周血 CTL 细胞杀伤活性的基本原理是正常情况下，乳酸脱氢酶 (LDH) 存在于活细胞的胞质内，不能透过细胞膜。只有在细胞受到损伤而使细胞膜通透性增加时，LDH 才能从受损细胞内释放出来。释放出来的 LDH 能够催化乳酸生成丙酮酸，并使氧化型辅酶 I (NAD') 变成还原型辅酶 I ( NADH2) , NADH2 通过递氢体--吩嗪二甲酯硫酸盐 (PMS) 还原碘硝基氯化氮哩蓝 (INT) 或硝基氯化四氮哇蓝 (NBT), 形成有色的甲朦化合物。(参考书籍-常用免疫学技术-第十二章-页码 102 页)

用途

LDH 法检测人外周血 CTL 细胞杀伤活性可用于检测外周血 CTL 的杀伤活性。

材料与仪器

器材：细胞计数板、96 孔圆底细胞培养板。

试剂：

① 抗 CD3 单克隆抗体（McAb），按试剂说明书操作 ;

② 2％ TritonX-100：2 ml TritonX-100 加至 100 ml 蒸馏水中 ;

③ 铬酸钠（Na₂⁵¹CrO₄）、胎牛血清（FCS）、效应细胞：PBMC；

④ 靶细胞：EB 病毒（EBV）转化的 B 淋巴母细胞。

步骤

LDH 法检测人外周血 CTL 细胞杀伤活性的基本过程可分为如下几步：

（一）效应细胞的制备

常规方法分离人 PBMC 或小鼠脾细胞，洗涤并用含 15％ FCS 的 RPMI 1640 营养液悬浮，计数后调整细胞浓度至 1x10⁷/ml 备用。

（二）靶细胞的制备

取细胞状态较好的 EBV 转化的 B 淋巴母细胞，用 RPMI 1640 培养液洗涤 2 次，每次 1000 r/min，离心 5 分钟，用含 10％ FCS 的 RPMI 1640 培养液重悬细胞后计数，调细胞浓度至 2.5x10⁵/ml 备用。

（三）靶细胞的标记

向 2 ml 上述制备细胞中加入 0.1 ml Na₂⁵¹CrO₄（100μCi），混匀后加至 24 孔细胞培养板中，置 37℃、5％ CO₂ 培养箱中孵育 18-24 小时。收集细胞，用 RPMI 1640 培养液洗涤 2 次，去除游离的 ⁵¹Cr，用 10％ FCS-RPMI 1640 培养液重悬细胞并计数，调细胞浓度至 1x10⁵/ml。

（四）结果测定

向 96 孔培养板每孔中加入 10μl 效应细胞、50μl 标记的靶细胞和 50μl 抗 CD3McAb，3 复孔。自发释放对照孔只加入靶细胞（不加抗体和效应细胞），最大释放对照孔加入 50μl 标记的靶细胞和 150μl 2％TritonX-100，自然杀伤细胞活性对照孔只加入标记的靶细胞和效应细胞（不加抗体）。每组均设 3 复孔。800 r/min，离心 5 分钟，置 37℃，5％CO2 培养箱中孵育 4 小时。分别吸取各孔培养上清 100μl 至试管中，γ计数仪测 cpm 值。

（五）结果计算

按下列公式计算细胞毒效应：

LDH 法检测人外周血 CTL 细胞杀伤活性