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        分离胰岛的糖刺激下胰岛素分泌检测

        相关实验:胰岛素功能相关检测实验

        别名:GSIS

        最新修订时间:

        材料与仪器

        器材:12 孔板、体视显微镜、CO2 培养箱、移液器、EP 管、离心机等

        试剂:

        ① Krebs-Ringer buffer(NaCl 115 mmol/L,KCI 5.4 mmol/L,CaCl2 2.38 mmol/L,MgSO,0.8 mmol/L,Na2HPO4 1 mmol/L,HEPES 10 mmol/L)


        ② BSA,fatty acid free(Sigma-Aldrich)


        ③ Rat/Mouse Insulin ELISA kit(LINCO Research)


        ④ 葡萄糖(glucose)贮液(1 mol/L)


        ⑤ 精氨酸(arginine)贮液(0.5mol/L)

        ⑥ KRB buffer(Krebs-Ringer buffer + 0.2% fatty acid free BSA)。

        步骤

        分离胰岛的糖刺激下胰岛素分泌检测的基本过程可分为如下几步:

        A. 准备 12 孔板,每个孔加入 750 μl 的 KRB buffer。

        B. 在体视显微镜下,将 CO2 培养箱中培养的胰岛用 20 μl 移液器挑选出来,放入 12 孔板中,每个孔放入 15~20 个胰岛,尽量保证各个孔的胰岛大小和数目一致。

        C. 将 12 孔板于 37 ℃ CO2 培养箱中放置 1 小时,使胰岛适应培养液的转换(从 RPMI 1640 到 KRBbuffer)。

        D. 将 12 孔板从培养箱中取出,放置桌上轻轻旋转摇动,胰岛会慢慢聚集到每个孔的中央。用 20 μl 移液器将胰岛移入到加有 KRB buffer(含有 2.8 mmol/L glucose)的新的 12 孔板中,每个孔 750 μl。然后将其置于 37 ℃ CO2 培养箱放置 1 小时,以得到胰岛的基础胰岛素分泌(basal secretion)水平。

        E. 将 12 孔板从培养箱中取出,放置桌上轻轻旋转摇动,胰岛会慢慢聚集到每个孔的中央。移取 100 μl 培养液于 EP 管中,放置于冰上保存,用于随后的基础胰岛素分泌水平的检测。

        (1)葡萄糖刺激下的胰岛素分泌:用 20 μl 移液器将胰岛移入加有 KRB buffer(含有 16.7 mmol/L glucose)的新的 12 孔板中,每个孔 750 μl。然后将其置于 37 ℃ CO2 培养箱 1 小时,以得到胰岛在糖刺激下的胰岛素的分泌(glucose-stimulated secretion)水平。

        (2)精氨酸刺激下的胰岛素分泌:用 20 μl 移液器将胰岛移入到加有 KRB buffer(含有 10 mmol/L arginine)的新的 12 孔板中,每个孔 750 μl。然后将其置于 37 ℃ CO2 培养箱 1 小时,以得到胰岛在精氨酸刺激下的胰岛素的分泌(arginine-stimulated secretion)水平。

        F. 将 12 孔板从培养箱中取出,放置桌上轻轻旋转摇动,胰岛会慢慢聚集到每个孔的中央。移取 100 μl 培养液于 EP 管中,放置于冰上保存,用于随后的葡萄糖或精氨酸刺激下胰岛素分泌水平的检测。

        G. 用 20 μl 移液器将胰岛移入到 EP 管中,加入 1 ml HBSS 或 KRB buffer,然后以 1000 r/min 在室温离心 2 分钟。沉淀下来的胰岛可以保存于 -80 ℃ 冰箱,以备用于提取蛋白或 RNA 之类的实验。

        H. 将步骤 5 和步骤 6 得到的培养液于 4 ℃,5000 r/min 离心 5 分钟,以去掉某些脱离的细胞碎片或杂质。上清液移入到新的 EP 管,用于胰岛素的 ELISA 检测。也可以将上清分装保存于 -80 ℃ 备用,但避免反复冻融。结果示例如图 8-9-8 所示。

        分离胰岛的糖刺激下胰岛素分泌检测

        注意事项

        1. 胰岛纯化出来后,应该在 RPMI 1640 中培养过夜,这样可以恢复胰岛的功能。因为分离纯化不可避免地会对胰岛造成一定的损伤,原代培养过夜后,胰岛外层受损的细胞会脱落,胰岛表面会重新形成包膜,轮廓变得圆润清晰。在实验开始前,要注意观察所培养的胰岛状态,如果胰岛的轮廓毛糙,证明胰岛抽提中损伤过大,不宜用于进行分泌实验。

        2. 所有溶液都要通过高压或过滤灭菌达到无菌的细胞培养要求。

        3. 每组胰岛至少应该安排 4 个孔,即 60 个大小均一的胰岛以上。

        4. 葡萄糖或精氨酸刺激后的培养液用于胰岛素的 ELISA 检测时,应用 KRB buffer 稀释 5~10 倍。


        来源:丁香实验

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