PCR法检测支原体污染

相关实验：细胞培养中支原体污染的检测实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

PCR 法检测支原体污染是 20 世纪 80 年代中期建立起来的一种体外 DNA 扩增实验，其该实验具有灵敏度高、特异性强、快速的特点，但其对实验环境的要求严格，实验成本较高，有时还有假阳性的现象出现。

原理

PCR 法检测支原体污染的基本原理是酶促 DNA 合成反应，即在 DNA 模板、引物和脱氧核糖核酸存在下，经 DNA 聚合酶的作用，使 DNA 链扩增延伸。

材料与仪器

器材：

① 支原体检测试剂盒（内有引物、阳性对照、内对照、StrataClean 树脂、缓冲液；美国 Stratagene 公司生产）

② dNTP

③ Taq DNA 聚合酶

④ 缓冲液

⑤ 琼脂糖

⑥ 矿物油

⑦ 超净工作台

⑧ PCR 仪

⑨ 电泳仪

⑩ 凝胶成像分析系统

⑪ 台式离心机

⑫ 旋涡混悬器

步骤

PCR 法检测支原体污染的基本过程可分为以下几步：

（1）样品的收集

待测细胞用无双抗培养基培养 7 d，用无菌容器取上清液 500 μl，4 ℃ 保存待测。

（2）模板的制作

在无菌的条件下，取细胞培养上清液 100 μl 于一无菌的 0.5 ml 塑料离心管内，盖好盖子，95 ℃ 水浴加热 5 min。

（3）打开盖子，向管内加 StrataClean 树脂 10 μl，盖好盖子，旋涡混悬器混合，离心 5～10 s，吸取上清至一新的塑料离心管中，模板制作完毕，4 ℃ 保存。

（4）PCR 反应反应体系最适条件为：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.38），50 mmol/L KC1，1.5～2.5 mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，2U Taq DNA 聚合酶；总反应体系为 50 μl，反应用去离子水均需用 12000 μJ/c㎡紫外灯照射。

A. 在 0.5 ml 塑料离心管中加入 35.2 μl 去离子水及 5 μl 10 x Taq 反应缓冲液。

B. 依次加入下列成分：0.4 μl dNTP（25 mmol/L）；0.4 μl Taq 酶（5 U/μl）；2 μl 引物。

C. 加 2 μl 去离子水，总体积 45 μl。

D. 加 5 μl 已制成的模板到反应体系中。

E. 阳性对照、内对照各 5 μl 加入到各自的反应体系中。

F. 取 1 支含有以上反应体系的离心管，加入 5 μl 去离子水作为阴性对照管。

G. 在反应体系中加入 100 μl 矿物油。

H. PCR 程序：