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        电穿孔转染法

        相关实验:DNA 转染实验

        别名:transfection,基因转染

        最新修订时间:

        简介

        运用物理或化学方法将外源 DNA 导入细胞的过程,称为 DNA 转染或基因转染(transfection)。采用该技术,既可将外源基因导入体外生长的细胞,用于研究基因的表达调控,亦可将外源基因导入体内细胞,用于基因治疗。电穿孔法转染效率较高,但需要昂贵的仪器。


        原理

        电穿孔转染法的原理是利用脉冲电场将 DNA 导入培养细胞,当细胞处于较高电压的电场中时,瞬间的电脉冲可将细胞膜穿孔,处于电场中的 DNA 得以进入细胞。常见的电穿孔仪根据其不同放电波形分为两种类型:一种是方波放电,另一种是指数衰减波放电。电穿孔法所需的 DNA 量较少,转染的效率也比较高。由于电穿孔是一种物理方法,较少依赖细胞类型,可广泛应用于各种细胞的转染,包括细菌、酵母、植物和动物细胞;而且,电穿孔法与用化学物质或病毒法进行转染相比,几乎没有生物或化学副作用。该法的缺点是对设备条件要求较高,而且不同的细胞对电压的高低、电脉冲的长短要求不一样,要达到最佳效果,需要进行预实验加以确定。

        材料与仪器

        器材:

        ① 1.5 ml Eppendorf 管

        ② 20 μl 微量移液器

        ③ 100 μl 微量移液器

        ④ 2 ml 移液器

        ⑤ 吸头、吸管、吸水滤纸

        ⑥ CO2 培养箱


        ⑦ 倒置显微镜

        ⑧ 荧光显微镜(450~490 nm)

        ⑨ 离心机、天平

        ⑩ 高压电击仪(Bio-Rad)、电击池

        试剂:

        ① 材料:60 mm 培养皿培养的 COS7 细胞、PBS 缓冲液稀释的 pCMV-GFP 质粒 DNA(1 μg / 1 μl)


        ② 无血清 DMEM 培养液


        ③ 胰蛋白酶溶液

        ④ 含 10% 小牛血清的 MEM 完全培养液

        ⑤ PBS 缓冲液(pH7.4)

        步骤

        电穿孔转染法的基本过程可分为如下几步:

        (1)于转染前 24 h,用 0.25% 胰蛋白酶溶液消化细胞。将 1x106 个细胞转接于 60 ml 培养皿中,加 4 ml 含 10% 小牛血清的 DMEM 完全培养液,置 37 ℃、5% CO2 培养箱中培养。

        (2)电穿孔前,在倒置显微镜下挑取对数生长的细胞,倾去培养基,用 PBS 缓冲液洗细胞 2 遍。

        (3)加入 1 ml 0.25% 胰蛋白酶,在 37 ℃ 孵育 4 min。

        (4)倾去消化液,加入 2 ml PBS 缓冲液终止消化,用吸管将 COS7 细胞吹下。

        (5)300 g 离心 5 min。

        (6)将细胞重新悬浮于 1 ml PBS 中,细胞记数,1 ml PBS 中含有 1x107 个细胞用于转染。

        (7)在细胞悬液中加入 10 μl pCMV-GFP 质粒 DNA(0.5~1 μg/μl),混匀后,室温下作用 5 min。


        (8)将 DNA- 细胞混合液移入灭菌的电击池中。

        (9)按照预实验的结果,选择合适的电压和脉冲时间,电击细胞(按电击仪的操作程序操作)。

        (10)电穿孔后,将 DNA-细胞混合液在室温下放置 10 min,使其损伤恢复。

        (11)将 DNA-细胞混合液移至 60 ml 培养皿中,加入 4 ml 含 10% 小牛血清的完全培养基,37 ℃、5% CO2 培养箱中培养 24 h。

        (12)24 h 后,在 450~490 nm 波长的光下用荧光显微镜观察 COS7 细胞的转染率和荧光强度。

        注意事项

        (1)电穿孔法转染不同的细胞,均需进行个别优化,选择合适的电压和脉冲时间,得到最优的转染条件。因为每种细胞的转染条件不同,不能从一种细胞的最优条件类推至其他细胞。

        (2)电穿孔时,电压高低和电脉冲的长短对转染效果影响很大。电压太小,细胞膜无变化,DNA 不能进入转染细胞;电压太大,容易损伤细胞。因此,电击时所用的电压和脉冲时间应该通过预实验来决定。预实验的电压和脉冲时间应以 60%~70% 的细胞能存活下来为准。

        (3)细胞的生长状态对电击转染的效率影响亦较大,一般以处于对数生长中期的细胞为佳。

        (4)电穿孔法所用的 DNA 浓度一般在 10~100 μg/ml 范围内。线形 DNA 的转染效率通常比超螺旋 DNA 高。

        来源:丁香实验

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