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        🔥 磷酸钙转染法

        相关实验:DNA 转染实验

        别名:transfection,基因转染

        最新修订时间:

        丁香实验推荐阅读

        合作专家 | 张荣钊博士

        病原生物学 福建医科大学

        简介

        运用物理或化学方法将外源 DNA 导入细胞的过程,称为 DNA 转染或基因转染(transfection)。采用该技术,既可将外源基因导入体外生长的细胞,用于研究基因的表达调控,亦可将外源基因导入体内细胞,用于基因治疗。磷酸钙转染法操作简单,无需昂贵的仪器设备,成本较低,已被许多实验室广泛采用。

        原理

        磷酸钙转染法的原理是在 pH = 7.1 环境中,DNA 分子带负电荷,在静电引力的作用下,带正电荷的粒子可与 PO 结合。当在溶液中加入 CaCl2 时,PO- 与 Ca2+ 形成磷酸钙,并与 DNA 共沉淀。待转染细胞可吞噬这些 DNA 沉淀,从而使 DNA 进入转染细胞中。

        材料与仪器

        器材: 

        ① 1.5 ml Eppendorf 管

        ② 20 μl 微量移液器

        ③ 100 μl 微量移液器

        ④ 2 ml 移液器

        ⑤ 吸头、吸管

        ⑥ CO2 培养箱

        ⑦ 倒置显微镜

        ⑧ 荧光显微镜(450~490 nm)

         

        试剂:

        ① 细胞

        ② 2×HEPES 溶液

        ③ 2.0 mol/L CaCl2 溶液

        ④ 0.25% 胰蛋白酶

        ⑤ PBS 溶液(pH = 7.05)

        ⑥ 超纯水

        ⑦ 含 10% 小牛血清的 DMEM 完全培养液

        ⑧ 0.1×TE(pH = 8.0)稀释的 pCMV-GFP 质粒 DNA(0.5~1 μg/μl)

        步骤

        磷酸钙转染法的基本过程可分为如下几步:

        (一)试剂配制

        (1)0.1×TE 缓冲液(pH 8.0):1.0 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0);0.1 mmol/L EDTA(pH 8.0)。

        (2)2×HEPES(pH = 7.05):HEPES,5.96 g;NaCl,8.00 g;KCl,0.37 g;Na2HPO4,0.106 g;葡萄糖,1.00 g。加入超纯水 480 ml,精调 pH 至 7.05,定容至 500 ml,再测定 pH 并调准。用 0.22 μm 滤器过滤除菌后储存于 4 ℃ 备用。

        (3)2.0 mol/L CaCl2:称取 10.8 g CaCl2·6H2O 溶于 20 ml 超纯水中,用 0.22 μm 滤器过滤除菌,分装成 1.0 ml 小份,-20 ℃ 保存备用。

        (4)含 10% 小牛血清的 DMEM 完全培养基:DMEM 培养基,补加 10% 小牛血清、100 U/ml 青霉素、100 mg/L 链霉素、2 mmol/L 谷氨酰胺、0.3 mmol/L 次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷、0.1 mmol/L 甘氨酸和脯氨酸,pH = 7.2。

        (二)转染过程

        (1)于转染前 24 h,用 0.25% 胰蛋白酶溶液消化细胞。将 1×106 个细胞转接于 60 ml 培养皿中,加 4 ml 含 10% 小牛血清的 DMEM 完全培养液,置 37 ℃、5% CO2 培养箱中培养。

        (2)转染前,取出培养液在倒置显微镜下观察,待细胞生长至 60%~70% 皿底面积时,挑取生长旺盛、细胞间有少量空隙的培养瓶,倒掉培养液,用 4 ml PBS 洗 2 次,待用。

        (3)DNA 沉淀液的准备。首先将 pCMV-GFP 质粒 DNA 溶解在 0.1×TE(pH = 8.0)中,使浓度为 0.5~1.0 μg/μl。

        在 Eppendorf 管中依次加入重蒸水 427.5 μl、pCMV-GFP 质粒 DNA 稀释液 10 μl,充分混匀,强烈振荡下加入 500 μl 的 2×HEPES 溶液,最后缓慢滴加 2.0 mol/L CaCl2 62.5 μl(加入 CaCl2 时应尽量缓慢,并不断轻轻敲击试管,以防形成结块)。

        (4)于室温下放置 5 min,出现轻度浑浊,20~30 min 时,缓慢形成细微的沉淀颗粒(沉淀粗大会影响细胞的吞噬作用,导致转染失败)。

        (5)将形成的 1.0 ml 沉淀物加到用 PBS 洗过 2 次的培养瓶内的细胞表面,于室温下放置 10 min,然后再于 37 ℃、5% CO2 培养箱中孵育 30 min,其间不断倾斜培养皿。

        (6)然后,倒掉沉淀物,加入新的完全培养液,继续在 CO2 培养箱中孵育 1~2 d。

        (7)24 h 后。在 450~490 nm 波长的光下用荧光显微镜观察细胞的转染率和荧光强度。

        (8)记录、分析实验结果。

        注意事项

        (1)该法对质粒 DNA 的质量要求极高,质粒溶液中不能含有杂蛋白及 RNA。

        (2)要制备出高效转染的磷酸钙-DNA 共沉物非常困难,其共沉物的粗细大小与转染效率的高低密切相关,通常以形成细密的沉淀为好。

        影响 DNA 沉淀形成的因素,除质粒 DNA 的纯度外,还与盐离子浓度、HEPES 缓冲液的 pH 值、反应温度、反应时间等因素关系很大,尤其是 HEPES 缓冲液的 pH 值必须严格限定在 7.05±0.05。

        来源:丁香实验

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