流式细胞术分析测定细胞可溶性蛋白质含量

最新修订时间：2023-04-11

简介

流式细胞术（flowcytometry assay，flow cytometry，FCM）是一种定量分析技术，是指利用流式细胞仪检测细胞内特异标记的荧光信号，从而测定细胞的多种生化物质（如膜蛋白、抗原、离子或 DNA／RNA 水平等）性质的方法，同时也是一项可以把具有相同荧光信号特征的某些细胞亚群从多细胞群体分离出来的细胞分析技术。

原理

流式细胞术分析测定细胞可溶性蛋白质含量的基本原理是将待测细胞被制成单细胞悬液，经特异性荧光染料或者含有荧光染料标记的抗体染色后加入样品管中。细胞进入流动室，在液压下单列排列形成单细胞流，与水平方向的激光光束垂直相交，被标记的细胞在激光下发出特定波长的荧光、能够为光电倍增管检测到，根据荧光强度以及荧光类型对细胞中蛋白表达水平进行定量分析。

材料与仪器

器材：离心机、离心管电泳仪、流式细胞仪

试剂：

① PBS (含 10％灭活正常山羊血清、0.0002％ Triton X-100 和 0.01％NaN₃)

② 甲醇

③ 针对目的蛋白的第一抗体工作液

④ FITC 标记的第二抗体

⑤ RNA 酶

⑥ PI

步骤

流式细胞术分析测定细胞可溶性蛋白质含量基本过程可分为如下几步：

A. 细胞的收集与固定：将待测细胞彻底弃去培养液，用 PBS 清洗；加入消化液消化细胞，血清终止反应；收集细胞悬液，4℃、100g 离心 10 分钟，离心前留出小部分细胞进行细胞计数；离心结束后，弃去上清，将细胞重悬于 100μl PBS 中，随后加入 900 μl 预冷（-20℃）的甲醇固定细胞，并将细胞保存于 -20℃。

B. 第一抗体结合：将 1.5 x 10⁶ 个上述固定的细胞转移至新的微量离心管中，于 4000g 离心 15 秒，收集细胞；弃去固定液，用 1.0 ml 4℃ 预冷的 PBS 重悬细胞，重复上述离心步骤；去除 PBS ，加入 0.5 ml 针对目的蛋白的第一抗体工作液，轻柔振荡混匀。将细胞与抗体于 4℃ 孵育过夜。

C. 染色：4000g 离心 15 秒，收集细胞，弃去抗体孵育液。用 0.5 ml PBS（含 10％灭活正常山羊血清、0.0002％ Triton X-100和0.01％NaN₃）重悬细胞沉淀，并轻柔混匀再离心重悬细胞以洗去未结合的第一抗体，重复洗涤 3 次；向细胞沉淀中加入 0.5 ml FITC 标记的第二抗体并轻柔混匀，37℃ 孵育 2 小时，期间间断性轻柔混匀并尽可能避光；重复洗涤步骤 2～3 次，并弃去上清；向细胞沉淀中加入 0.5 ml RNA 酶并轻柔混匀，37℃ 孵育 30 分钟。

D. 样品上机分析：加入 0.5 ml PI（DNA 染色），使溶液体积为 1 ml，轻柔混匀。用 40～60 μm 的尼龙膜过滤细胞，上机并进行数据分析。

注意事项

1. 所有的液体溶液和试剂都应通过高压消毒或者过滤除菌的方式灭菌，并无菌保存。

2. 消化收集细胞时仔细控制细胞消化时间，避免细胞成团

3. 每个样品的起始细胞数至少为 1.5 x 10⁶，在固定和染色过程中会损失一些细胞，最后上机检测时细胞数大约为 1.0 x 10。减小离心管容积，并使用聚丙烯管能够减少细胞流失。

4. 清洗溶液中可加入山羊血清以降低抗体的非特异性结合。

5. 调整固定液的量能够改变细胞的浓度。使用甲醇作为固定液时，PBS和甲醇的最佳体积比为 1:9。对于一些蛋白质分子在不同的固定条件常得出不同的结果。已经固定的细胞可以在 -20℃ 放置 1 年以上，不会引起抗原丢失。

6. 在用流式细胞术确定抗体稀释度之前，应该先采用免疫荧光方法明确第一抗体以及第二抗体的稀释度。为确定第一抗体是否过量，使用相同第一抗体稀释液处理两组样品（除第一抗体外，这两组样品的其他处理应该是完全一致的），顺次进行流式细胞仪检测，对比荧光信号结果，如果第一抗体稀释度过高，第二个样品发出的荧光信号将明显弱于第一个样品。

7. 在流式细胞术实验过程中，应该严格控制离心条件，一方面尽量减少丢失细胞，另一方面将机械剪切力对细胞的损伤降到最低。

常见问题