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        噬斑试验测定滴度

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        1. 用含 10% 胎牛血清的 TNM-FH 培养液稀释处于对数生长期的 Sf 9 细胞至约 5 × 105 细胞/ml。在噬斑试验之前几小时,以两种不同的密度(2 × 106 和 1.5 × 106 细胞/ml)将细胞种于 60 mm 组织培养皿中。对病毒储液的每一稀释度均设复皿(二个组织培养皿),27℃ 培养。


        2. 根据病毒储液的来源,用 TNM-FH /10% FBS 培养液制成 5 ml 病毒储液的系列稀释液。

        高滴度病毒储液:10-6、10-7、10-8 稀释

        转染上清(野生型病毒环状 DNA):10-4、10-5 和 10-6 稀释

        转染上清(野生型病毒线性化 DNA):10-1 和 10-2 稀释

        单个噬斑:10-1、10-2 和 10-3 稀释


        3. 用一根灭菌巴斯德吸管小心从细胞(步骤 1)中吸去培养液。每一稀释度的病毒均加 1 ml 至各复皿中 27℃ 温育 1 h, 加入病毒时摇动培养皿以保证病毒能均匀感染细胞。


        4. 温育 1 h 后,制备琼脂糖顶层覆盖物。


        5. 用一根灭菌巴斯德吸管吸去病毒上清液,加入 4 ml 琼脂糖覆盖物。让琼脂糖室温固化 10~20 min (让凝结的水滴散去)。用 Parafilm 膜分别封住每个平皿(以防干涸),27℃ 培养 6~8 天。


        6. 在噬斑形成较好而且裸眼容易看出的培养皿上,计数每一稀释度形成的噬斑数,计算病毒滴度(pfu/ml)。在 10-7 稀释度的培养皿形成 10 个噬斑或在 10-8 稀释度的培养皿形成 1 个噬斑,病毒滴度计算为 108 pfu/ml。


        7. 如果裸眼辨别噬斑时遇到困难,则用台盼蓝染色。制备台盼蓝覆盖物,倾覆 1 ml 至培养了 6~8 天噬斑形成较好的培养皿中。27℃ 过夜温育培养皿,让染料扩散进入死细胞,计数蓝色噬斑的数目并确定病毒滴度。(噬斑内的死细胞将吸收台盼蓝染料,噬斑周围的活细胞不会吸收台盼蓝染料。)


        确定病毒滴度的另一方案是终点稀释法。采用这种方法,需制备一系列病毒稀释液,并以此感染微量滴定板中的细胞,然后记好每一孔是否存在病毒感染并确定 50% 终点。然而用这种方法滴定重组病毒储液,得到的结果与噬斑试验相比较难解释。野生型病毒由于包含体的聚集很容易计数,而重组病毒则由于没有包含体有时难以计数。

        注意事项

        1. 每一稀释度均设复皿是必需的,因为噬斑实验的结果有差异。通常测定 3 个不同稀释浓度的病毒所形成噬斑,共需要 12 块组织培养皿测定每种病毒储液的浓度(6 块培养皿以 1.5 × 106 细胞/ml 接种,6 块培养皿以 2 × 106 细胞/ml 接种)。


        2. 做病毒噬斑试验时,细胞单层培养物的密度很关键。如果培养 5 天后,噬斑仍然太小,则细胞接种太密;如果噬斑太大和扩散,则细胞接种太稀。对特定细胞系,可用一系列不同的细胞密度通过噬斑实验确定其最佳噬斑细胞密度。


        3. 如果重组病毒含有 lacZ 基因,如来自 pBlueBacIII (Invitrogen) 或 pAC360 β-Gal 的重组体,在琼脂糖固化前加入 150 μg/ml X-gal(来自 20 mg/ml 储存液,储存液由无菌的二甲基甲酰胺制备, -20℃ 可保存数月),重组体的噬斑因显示明亮的蓝色容易与非重组体辨别。


        4. 步骤 5 中,若使用加湿的 27℃ 培养箱,培养皿无需用 Parafilm 膜封住。


        5. 噬斑持续形成至 2 周。如果在 2 周时还看不到噬斑,可能由于细胞接种密度过高所致,应该以较低密度(在 1 × 105 和 1.3 × 106 细胞/平皿之间)重新接种。

        来源:丁香实验

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