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        基本方案 从单层培养中制备

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤


        1. 以 1.8×107 Sf 9 细胞/瓶的密度,将细胞接种于两个 150 mm 培养瓶,在含 10% 胎牛血清的昆虫细胞培养液 TNM-FH 中培养。27℃ 温育 1 h 使细胞贴壁。


        2. 当细胞贴壁时,取适量的待接种的杆状病毒于 30 ml 新鲜的含 10% 胎牛血清的昆虫细胞培养液 TNM-FH,使感染复数(MOI)为 0.1~1。细胞贴壁后,移去培养液,每个培养瓶中各加入 15 ml 含有病毒的培养液。

        MOI 以 pfu/细胞来表示。感染给定数目细胞的病毒接种物的体积=MOI (pfu/细胞)× [细胞数/毒种储液的滴度(pfu/ml)]


        3. 27℃ 温育数日。每天在倒置显微镜下观察感染迹象,如细胞病变效应(如果使用包含体阴性重组病毒),或包含体(如果使用野生型杆状病毒或包含体阳性重组病毒)。包含体具高折光性,带微黄的绿色晶体状,在光学显微镜下很容易发现。


        4. 当大多数细胞含有包含体或显示出细胞病变效应时(通常在感染后 4~5 天),将培养液移入灭菌试管中,4℃,1000 g 离心 10 min, 将上清移至一新的灭菌试管。分别吸取 1 ml 上清移至几个螺口冻存管中,置于液氮罐长期保存。将剩余的病毒置暗处 4℃ 短期保存。该步骤应可得到约 40 ml (1~3)× 108 pfu/ml 的病毒储液。


        注意事项

        如果待扩增的病毒源自单个噬斑(见病毒储液滴度测定实验),将琼脂糖块置于一含 0.5 ml TNM-FH/10% FBS 的小离心管中 4℃ 旋转过夜。再按步骤 1.1 感染 Sf 9 细胞:在 100 mm 培养皿中,用 2 × 106 细胞,27℃ 温育 1 h。加入 8 ml TNM-FH /10% FBS 培养液,27℃ 温育 4 天。按步骤 1.4 收获病毒。噬斑法确定滴度(见病毒储液滴度测定实验), 重复步骤 1.1~1.3,扩增病毒以获得高滴度的储液。如果昆虫细胞已适应无血清培养,病毒储液也可用无血清培养的昆虫细胞制备(见昆虫细胞保存培养实验)。用无血清培养液代替 TNM-FH/10% FBS,按步骤 1.1~1.4 进行即可。

        来源:丁香实验

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