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        培养细胞中病毒 DNA 的提取

        相关实验:病毒 DNA 的提取实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        1. 贴壁培养细胞倾去培养液,加 PBS 洗 2次,加胰蛋白酶消化 (37℃, 5~10 min)后移入Ep管中,2000 r/min 离心 10 min, 弃上清液,用 PBS 悬浮细胞,离心洗涤 2~3次,用 PBS 重新悬浮细胞, 3500 r/min, 弃上清液。


        2. 悬浮细胞的培养 移入 Ep 管中,以 2000 r/min 离心 10 min, 弃上清液,用 PBS 悬浮细胞,余下的操作同贴壁培养细胞。


        3. 加人 1/2 体积 2M NaCl 和 1/2 体积 20% PEG 6000( 聚乙二醇 6000), 充分混匀溶解,置于 4℃ 8~12 h 或过夜, 3500 r/min 离心 20 min, 弃上清液。


        4. 加 1/10 原培养液体积的裂解液,混匀, 37℃作用 2~3 h 。


        5. 用等体积的平衡酚抽提 1次,再用氯仿/异戊醇 (24:1)抽提 3~4次。


        6. 加入 1/10 体积 2.5mmol/L NaAc pH 和 2倍体积无水乙醇,置- 20℃过夜。 15000 r/min 离心 10 min, 弃上清液,用 70% 乙醇洗 1次,倒置离心管自然干燥或真空抽干。


        7. 加适量 TE 缓冲液溶解沉淀,做 DNA 模板。获得病毒DNA。

        常见问题

        1. 裂解液由 0.5%SDS 、10mmol/L Tris-HCl(pH 7.8)、5 mmol/L EDTA 、10 µg/ml RNase和 50µg/ml 蛋白酶 K 组成。


        2. TE 缓冲液由 10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.8) 和 10 mmol/L EDTA 组成。

        来源:丁香实验

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