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        植物组织中DNA的提取与测定

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        一、原理

        脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid,DNA)是一切生物细胞的重要组成成分,主要存在于细胞核中,盐溶法是提取DNA的常规技术之一。从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA,其中还含有大量RNA,即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。DNA不溶于0.14mol/L 的NaCl溶液中,而RNA则能溶于0.14mol/L 的NaCl溶液之中,利用这一性质就可以将二者从破碎细胞浆液中分开。制备过程中,细胞破碎的同时就有Dnase释放到提取液中,使DNA因被降解而影响得率,在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸盐和EDTA,既可抑制酶的活性又可使蛋白质变性而与核酸分离,再加入阴离子去垢剂0.15%的SDS,经过2h搅拌,或用氯仿-异醇除去蛋白,通过离心使蛋白质沉淀而除去,得到的是含有核酸的上清液。然后用95%的预冷乙醇即可把DNA从除去蛋白质的提取液中沉淀出来。

        二、材料、 仪器 设备及试剂:

        (一)材料:去胚乳的小麦芽,新鲜花椰菜等。
        (二) 仪器 设备:1. UV-120分光光度计;2. 磨口三角瓶;3. 具塞刻度试管;4. 研钵等器皿。

        试剂 :
        1. 研磨缓冲液:称取59.63gNaCl,13.25g柠檬酸三钠,37.2gEDTA-Na分别溶解后合并为一,用0.2mol/L 的NaOH调至pH7.0,并定容至1000ml。
        2. 10×SSC溶液:称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠,分别溶解,一起定容至1000ml。
        3. 1×SSC溶液:用10×SSC溶液稀释10倍。
        4. 0.1×SSC溶液:用1×SSC溶液稀释10倍。
        5. Rnase溶液:用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml 的酶液,用1mol/L HCl,pH至5.0,使用前经80℃水浴处理5min(以破坏可能存在的Dnase)。
        6. 氯仿-异戊醇:按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。
        7. 5mol/L 高氯酸钠溶液:称取NaClO 4 .H 2 O 7 0.23g,先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。
        8. SDS(十二烷基硫酸钠)化学 试剂 的重结晶:将SDS放入无水酒精中达到饱和为止,然后在70~80℃的水浴中溶解,趁热过滤,冷却之后即将滤液放入冰箱,待结晶出现再置室温下凉干待用
        9. 1mol/L HCl。

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