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        步骤一 偶联寡核苷酸到溴化氰活化的 Sepharose 4B

        相关实验:核酸亲和层析法纯化蛋白质实验

        最新修订时间:

        原理

        DNA 偶联至溴化氰活化的 Sepharcse 4B 是通过它们本身的碱基实现的。从理论上讲,该方法也许干扰最佳结合序列的接近路径,但是这样一个简单的方法一直被广泛地成功应用。偶联效率的定量检测可经 A260 值测定评估,或者更精确地从偶联介质上水解核酸和进行磷酸盐测定。

        材料与仪器

        步骤


        1. 混悬 1.5 g CNBr-Sepharose 4B 在水中,室温静置 30 min 约可获得 5 ml 溶胀的胶。经烧结玻璃漏斗过滤,当水分滤尽而溶胀的胶仍是潮湿的时候,立即停止抽滤;


        2. 胶在漏斗内,依次用 4℃,200 ml mmol/L HCl、200 ml 水和 200 ml 10 mmol/L,pH 8.0 磷酸钾缓冲液清洗;


        3. 将胶移入含 2 ml 10 mmol/L,pH 8.0 磷酸钾缓冲液的 15 ml 试管内;


        4. 加 50 ul 寡核苷酸到试管,约每 ml 胶需用 2nmol 寡核苷酸。室温下振摇 16 h;


        5. 再移入烧结玻璃漏斗,抽滤除去液体;


        6. 先后用 200 ml 水和 100 ml 1 mol/L,pH 8.0 乙醇胺-盐酸清洗;


        7. 将胶移入聚丙烯试管,在 7 ml 1 mol/L,pH 8.0 乙醇胺-盐酸中混悬。室温下摇 4~6 h。该步骤灭活未偶联的活化的胶;


        8. 在烧结漏斗中,依次用下述溶液洗胶。100 ml 10 mol/L,pH 8.0 磷酸钾缓冲液;100 ml 1 mol/L,pH 8.0 磷酸钾缓冲液;100 ml 1 mol/L KCl;100 ml H2O;100 ml 储存缓冲液(10 mmol/L pH 7.6 Tris-HCl,0.3 mol/L NaCl,1 mmol/L EDTA,0.02% NaN3


        9. 4℃可储存一年。

        来源:丁香实验

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