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        基本方案 用线性化杆状病毒DNA

        最新修订时间:

        原理


        材料与仪器

        步骤

        1. 接种 2 × 106 细胞于 60 mm 培养皿中,接种 3 个培养皿,在含 10% FBS 的 TNM- FH 昆虫培养基中培养,27℃ 培养直到细胞贴壁。


        细胞在平坦光滑的表面才能贴得更加牢固,这个过程常常需要大约 5 min。如果在此时间后细胞 还没有贴壁,说明细胞状态不好或所用的培养皿不好(如有盖培养皿不能用于组织培养)。


        昆虫细胞的状态十分重要,只有能快速分裂的细胞才能使用。


        2. 待细胞贴壁后,在离心管中加入 0.5 μg ORF 1629 缺失的线性 AcMNPV DNA 和 2~5 μg 重组杆状病毒转移质粒。轻轻振荡混匀,放置 5 min, 再加入 1 ml 转染缓冲液 B。


        3. 制备阳性对照:在离心管中加入 0.5 μg ORF 1629 缺失的线性 AcMNPV DNA 和 2 μg 阳性对照载体 pVL 1392-XylE DNA。轻轻振荡混匀,放置 5 min, 再加入 1 ml 转染缓冲液 B。


        4. 第一个培养皿(步骤 1)进行共转染试验,做好记号。吸出旧培养基,加入 1 ml 转染缓冲液 A,必须保证液体全部覆盖细胞。


        5. 第二个培养皿(步骤 1)作为阳性对照,做好记号。吸出旧培养基,加入 1 ml 转染缓冲液 A,同步骤 4。


        6. 第三个培养皿(步骤 1)作为阴性对照,做好记号。吸出旧培养基,加入 3 ml 新鲜的 TNM-FH/10% FBS 培养基,不加入任何 DNA。


        7. 将 1 ml 步骤 2 制备的溶液(含有目的基因的载体)逐滴加入共转染培养皿中,每加入 3~5 滴,来回地晃动平皿,混合液滴。


        在此过程中,可能会形成磷酸钙/DNA 沉淀,这种沉淀对于转染是有利的,它是以乳白状形式出现的。


        8. 将 1 ml 步骤 3 制备的溶液(含有阳性载体)逐滴加入阳性对照培养皿中,同步骤 7。


        9. 将此三块板放入 27℃ 培养箱中培养 4 h。


        钙沉淀的暴露时间对于获得良好的转染结果十分重要。如果培养的时间太长,细胞的存活率会有很大的下降,对于不同的细胞系,最适培养时间也不同。对于 Sf 9 细胞,最适培养时间是 4 h。


        10. 4 h 后,吸出共转染平皿和阳性对照平皿中的培养基(不包括阴性对照平皿)。每个板中加入 3 ml 新鲜的 TNM-FH/10% FBS 培养基,来回地晃动平皿,再次吸出所有的培养基。每个板中加入 3 ml 新鲜的 TNM-FH/10% FBS 培养基。27℃ 培养 4~5 天。


        没有必要更换阴性对照平皿中的培养基。


        11. 4 天后,在倒置显微镜下观察三块平皿中的感染情况,将共转染平皿与阳性对照平皿和阴性对照平皿对比。


        被感染的细胞比未被感染的细胞大,细胞核也大。由于从转染后的早期就停止分裂,与没有转染的细胞相比细胞的密度要低很多。而且,转染了的细胞不能很好的贴壁,悬浮在培养基中的细胞占很高的百分比。


        12. 5 天后,收集共转染平皿和阳性对照平皿的上清。用噬斑试验确定病毒滴度或用终端稀释试验估计病毒滴度(见病毒储液滴度测定实验)。


        13. 裂解转染细胞(对于非分泌型重组蛋白)检测目的蛋白的表达或将上清(对于分泌型重组蛋白)分成多份,进行相应试验。


        除非对目的蛋白有灵敏的检测手段,否则在这一步重组蛋白不能被发现。


        14. 加入 100 μl 500 mmol/L 儿茶酚/50 mmol/L 硫酸氢钠到阳性对照平皿检测 XylE 蛋白的表达。大约 5 min, 被感染的细胞变成亮黄色。


        15. 将转染上清液转入无菌的 15 ml 的离心管中,4℃,1000 g 离心 10 min。将病毒上清液放入新的无菌管中,避光,4℃ 保存。


        16. 扩增病毒上清,以获得可用于生产重组蛋白的高滴度病毒储液(见杆状病毒储液制备实验)。

        注意事项

        在共转染前,需要制备 ≥ 10 μg 提纯的质粒 DNA。注意质粒要尽可能的干净,使用 不纯的质粒,细胞在转染后可能溶解,导致病毒的滴度很低。转染后 24 h, Sf 细胞的存活率应 > 97%。

        来源:丁香实验

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