技术和方案14 PCR介导基因破坏法

相关实验：酵母遗传学方法实验

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

步骤

A. —步法 PCR 破坏基因程序该操作使用尾部带有与目的基因同源50个核苷酸的引物对，使 PCR产物能靶向性地插人某基因座。设计的引物一般来讲，通过一个选择性标记来替换酵母基因的可读框序列。每对引物末端都有一段特异序列可以用来从质粒模板扩增不同选择性标记，该方法由 Wach (1996) ，Longtine 等（1998)与 Goldstein 和 McCusker (1999)建立。同源区较短会降低基因替换的效率，然而，标记基因跟酵母基因不同源时，标记基因通常能正确插人目标座位；如果标记基因来自酵母基因组， PCR产物通常会错误插入靶位或者基因组别的座位。基因敲除在二倍体酵母中进行，随后要分离孢子，用四分法以保证仅有一个标记基因正确插人目标座位，而在其他位置未发生突变。 1 ) 反应混合物 l 〇ng质粒模板DNA 5pl 10X Tag聚合酶缓冲液 5/jJ 2mmol/L dNTP 混合物 5jul 5jumol/L 引物 1 5|ul Spmol/L 引物 2 0. 5jul lOmg/ml BSA I " T ag聚合酶补水至50pl 提示：如果要扩增 N A T 盒式结构，因其高的 G C 含量，反应必须补充 DMS〇至 1 0 % 。 2) PCR循环条件 94°C4m in; 94°C lm in 、 55°C lm in 、 72°C lm in /kb， 25 个循环； 72°C 20m in; 4°C 保存。 3) PCR产物的纯化用 50jul 1 : 1 的酸：氯仿抽提PCR产物， 13 000r/m in 离心 5m in，转移上清到一只新的离心管中。加 SjbJSmol/L 的乙酸钠（ p H 7 . 0 ) 和15〇 4无水乙醇在一20°C沉淀 lh 。 13 000r/min 离心 lOmin，去除上清，烘干沉淀。溶 DNA 在 25|ul (p H 8.0) TE 中，取 10/xl D N A 按高效转化法转化酵母。（技术和方案1，酵母的高效转化）

材料通用引物序列正向引物： 5'-(基因专一性序列） -C G G A TC C C C G G G TTA A TTA A -3' 反向引物： 5^ (基因专一性序列） -G A A T T C G A G C T C G T T T A A A C -3' 质粒模板 pFA6a-kanMX6 PCR扩增大肠杆菌的々 aW 基因，由 T X F 启动子和终止子控制产生 G418抗性。 PFA6a-His3MX6 PCR扩增酵母的/u‘55+ 基因，由 T £ F 启动子和终止子控制。 PAG25 PCR扩增链霉菌的n‘ 基因，由 T E F 启动子和终止子控制产生诺尔丝菌素抗性。 YPD加 G418筛选用标准的YPD配方添加200mg/L 有效浓度的G418二硫盐。 G418粉可以在倒平板时直接加人培养基中。因为表型滞后，必须让细胞恢复生长4h 或过夜培养。 YPD 加 NAT 溶诺尔丝菌素在纯水中至l 〇〇mg/m l的浓度并无菌过滤，储存在一80°C 。倒平板前，添加 lm l储存液到1LYPD培养基中。因为表型滞后，必须允许细胞恢复生长4h 或过夜培养。 B. 双融合PCR 法基因破坏此方案由Amberg等（1995)发展。在酿酒酵母中基因置换需要同源重组，长的同源序列可以极大地提高重组效率。通常，加尾序列短的引物不能提供精确有效的基因置换同源区。另外，如果标记基因在酵母基因组中存在，基因置换会发生在错误座位。通过提高破坏盒式结构末端同源区的长度，这一问题虽然不能消除，但能改善。这能够通过下面描述的双融合PCR操作来完成，该操作可以适当修改以适合前面提及的使用F1 和 R1 引物的kanMX盒式结构及与 F1 和 R1 引物有序列互补的引物2 和 3 的 PCR操作（图 14. 1)。引物1 5,端引物3 3,端引物2 ml3正向引物、标记基因引物4 ml3反向引物图 14.1 通过双融合PCR构建一个破坏盒式结构

$程序 1 ) 在各 PCR反应中，用至少200个碱基距离的引物对分别扩增感兴趣基因的上游和下游末端。引物2 从 M 13正向引物互补的24个碱基处开始，引物 3 从 M 13反向引物互补 24个碱基处开始。 PCR扩增标记基因用M 13正反向引物。琼斯构建的载体对于标记基因的扩增是有用处的。 PCR条件如下： 1〜5M1酵母基因组D N A 或 10ng质粒模板DNA 5 4 5^11101/1^引物 1、 M 13正向引物和引物3 5 4 5|umol/L 引物 2、 M 13反向引物和引物4 5 ^ 1 0 X T 叫聚合酶缓冲液 5jlJ 2|umol/L dNTP 混合物 I - Tag聚合酶补水至50W 总体积 PCR循环条件 94°C4m in; 94〇C lm in 、 SStnm in、 72°C3m in， 25 个循环； 72°C20m in; 4°C保存。 2 ) 低熔点琼脂糖胶纯化所有PCR扩增片段。 3 ) 在 65°C进行第一轮融合PCR融合 5'端片段和标记基因， PCR体系如下 2. 5jlJ 片段 DNA 5jul 5|umol/L 引物 1 5|ul 5jumol/L M 13 反向 5M1 10X T 叫聚合酶缓冲液 5 4 2^m ol/L dNTP 混合物 ljul Tag聚合酶补水至5〇 W 总体积 PCR循环条件 94°C4m in; 9rC lm in 、 55°C lm in、 72°C3m in， 25 个循环； 72°C20m in; 4°C保存。 4 ) 低熔点琼脂糖胶纯化第一轮融合PCR扩增片段。 5 ) 在 65°C进行第二轮融合PCR，融合 3'端片段和第一轮融合PCR扩增片段， PCR体系如下 5 4 各 PCR扩增 D N A 片段 lOpl 5； umol/L 引物 1 lOpl 5jumol/L 引物 4 1(^110\1叫聚合酶缓冲液 lOjul 2|Ltmol/L dNTP 混合物 2“ T叫聚合酶补水至lo o y 总体积 PCR循环条件 94°C4m in; 94°C lm in、 55°C lm in、 YYCSmin， 25 个循环； 72°C20m in; 4°C保存$

6 ) 琼脂糖胶电泳检测PCR产物。用 1 : 1 的酚：氯仿抽提PCR产物， 13 OOOr/m in离心 5mm，转移上清到一只新的离心管中，加 10jLJ3m〇l/L 的乙酸钠（ p H 7 . 0 ) 和 300^1无水乙醇于一20°(：沉淀让。 13 000转离心101^11,去除上清烘干沉淀。溶 D N A 在 25jlJ (pH8.0) T E 中，取 IOjuID N A 按高效转化法转化酵母。（技术和方案 1，酵母的高效转化）提示：琼脂糖胶电泳纯化通常能提高融合PCR的效率。最好用低熔点琼脂糖胶电泳纯化PCR产物，用胶块2 倍体积的TE (PH 8.0)抽提D N A 后，用酚抽提两次，再用无水乙醇沉淀。材料和溶液 10 X T ag聚合酶缓冲液 0. 2m ol/L Tris (pH8. 3) 15m mol/L MgCl2 0. 25m ol/L KC1 0. 5 % Tween-20 M 13 正向引物： 5'-CGC CAG GGT T T T CCC AGT CAC GAC-3' M 13 反向引物： 5'-AGC GGA TA A CAA T T T CAC ACA GGA-3' 基因专一性引物2: S'-GTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCG^ (基因专一性引物) 基因专一性引物3: 5'-TCC TGT GTG AAA TTG T1A TCC GCT-3、基因专一性引物）质粒模板 P JJ2 1 5 带有克隆进p U C 1 8 多克隆位点的酿酒酵母的H L S 3 基因。 P JJ2 4 2 带有克隆进p U C 1 8 多克隆位点的酿酒酵母的U R A 3 基因。 P JJ2 8 1 带有克隆进p U C 1 8 多克隆位点的酿酒酵母的T R P J 基因。 P JJ2 8 2 带有克隆进p U C 1 8 多克隆位点的酿酒酵母的基因。提示：所有这些标记基因有逆向克隆质粒

来源：丁香实验

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