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        技术和方案7 质粒 DNA 的羟胺突变

        相关实验:酵母遗传学方法实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        1.临用之前制备羟胺溶液,置冰上待用。

        2.将用 CsCl 纯化的 10 埤质粒 DNA 加到含 500ul 羟胺溶液的微量离心管中。

        3.在 37°C 下温育 20 h。

        4.加人 10ul 的 5mol/L NaCl,50 ul 1mg/ml 的牛血清白蛋白(BSA) 和 1ml 无水乙醇以终止反应,置 -70°C 10 min 以沉淀 DNA。

        5.离心 10min,小心倾其所有上清液。

        6.重悬 DNA 于 100ul TE 缓冲液(pH8) 中,再加人 10ul 3mol/L 的乙酸钠和 250ul 的无水乙醇,在 -70°C 下放置 10min,重复步骤 5。

        7.让沉淀自然干燥,重悬于 100ul TE 缓冲液(pH8)。

        8.该 DNA 可直接用于大肠杆菌或酵母的转化。相对于非诱变 DNA,已诱变 DNA 在酵母中的转化效率降低了 3/4。Ura-质粒在大肠杆菌中可被检出。大肠杆菌菌株可以是 wng+,但其转化效率将降低至原来的 1/10~1/100。当转化大肠杆菌菌株(DB6507) 时,如果 URA3 基因约占整个质粒 DNA 的 10%,有望获得约 4% 的 Ura-菌落。用同样的诱变 DNA 母液转化酵母,将得到约 1% 丧失功能的突变 (敲除)。约有 10% 的突变体是温度敏感型的。

        来源:丁香实验

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