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基本方案辅助病毒缺陷复制子储存液的制备

相关实验：应用辅助病毒缺陷 HSV-I 扩增载体进行基因传递实验

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

试剂、试剂盒	G415 PBS 0.25%胰蛋白酶 0.02%EDTA 杜氏改良培养基漂白剂去血清培养基
仪器、耗材	组织培养瓶 Probe超声仪 —次性注射器锥底离心管加湿培养箱针式过滤器离心管干冰乙醇浴直径组织培养皿

步骤

1 . 在 D M E M / 1 0 % F B S (含 5 0 ( V g / m l G 4 1 8 ) 中培养2-2细胞。每周传代两次，每次取约 1/5新鲜培养基（ 2 0 m D 到新的75cm2 组织培养瓶。 2 . 转染前一天，除去培养基， P B S 清洗培养板两次，然后加一薄层胰蛋白酶/ E D T A ， 37°C孵育 IOmin使细胞从培养板上脱离。血球计数板进行细胞计数（附录 31) 后接种 I. 2 X 1 0 6 个细胞到6 0 m m 培养皿中，力 D 3ml D M E M / 1 0 % F B S 。 3 . 每个需要转染的6 0 m m 培养皿，加 IOOjLd Opti-MEM I 去血清培养基到每个15ml离心管中。其中一个15ml离心管，力〇 2jug PacHl切的cos质粒混合物（5 种克隆，每种〇.4pg; 支持方案1 ) 和 0.6鸿复制子D N A 。另一个离心管，加入12一LipofectAMINEo 4 . 汇集两个管子中的物质，混匀（不能振荡），室温孵育45min。 5 . 取 2ml Opti-MEM I 清洗前一天得到的培养物（第 2 步）。加 I. Iml Opti-MEM I 到第 4 步制备好的含有 D N A - L i p o f e c t A M I N E 转染混合液的管子中（总体积 1.3ml)。吸去培养基（细胞为100%汇合），加转染混合液，孵育 5. 5h。 6 . 吸去转染混合液， 2ml O p t i - M E M I 清洗细胞3 次，加 3. 5ml D M E M / 6 % F B S 孵育2〜3d。转染 2 d 后，至少 5 0 % 的细胞应该成病理症状（细胞变圆但仍然贴壁）。在包装实验中，表达 G F P 基因的复制乎载体的应用可以方便的检测转染效率和迁移。 7 . 用细胞刮棒将细胞刮到培养基中，转移悬液到 1 5 m l 离心管中，用干冰/乙醇浴和 37°C水浴反复冻融3 次。 8•将含有细胞的离心管放置在装有冰水混合物的烧杯中，把超声探针浸入细胞悬液液面 0 . 5 c m 处， 2 0 % 输出功率处理20s。

9. 1400g ， 4°C ，离心 IOmin后除去细胞碎片， 0.45p m 针式过滤器接在20m l —次性注射器上过滤上清到新的15m l 离心管。取一部分样本做滴度测试（支持方案2)，然后分离剩余的原种分成I m l 的等份，在干冰/乙醇池中冻存，储存于一80°C (至少6 个月）。在保存前浓缩（第 IOa和 Ila步）或纯化和浓缩（第 IOb〜13b 步）原种。离心沉淀 IOa. 将第 9 步中的载体溶液转至一 30m l 离心管， 4°C ， 20 OOOg•离心2h 。 11a. 用小体积（如 300^1)的 1 0 % 的蔗糖溶液重悬沉淀。取出一份原种测滴度（支持方案 2)，然后等量分装（如 3〇4)，冻存于干冰/乙醇池。储存于一80°C (至少6 个月）。用不连续的蔗糖梯度纯化和浓缩 IOb. 在 Beckman Ultra-Clear 25m m X 89m m 的离心管将如下溶液在管中分层，准备鹿糖梯度： 7ml 60% 簾糖； 7ml 30% 蔗糖； 3ml 1 0 % 蔗糖（上层）。 lib. 小心地将第9 步中的载体原液加入梯度上面， 4°C ， 10 O O O g 离心 2h。 12b. 从上面吸去1 0 % 和 3 0 % 的蔗糖层，在 3 0 % 和 6 0 % 蔗糖层之间的表面收集病毒。转移至广 Beckman Ultra-Clear 14m m X 95m m 的离心管，力口入约 15ml 的 P B S ， 4°C ， 10 〇〇〇 g 离心 I h 以沉淀病毒颗粒。用纤维可视镜观察时， 3 0 % 和 6 0 % 蔗糖层之间的表面可见雾状带。 13b, 用小体积（如 3 ( % 1 ) 的 1 0 % 的蔗糖溶液重悬沉淀，等量分装（如 30juD。冻存于干冰/乙醇池。储存于一80°C (可保持稳定至少6 个月）。冻存前，保留一份原液测定滴度（支持方案2)。支持方案 1 制备用于转染的 HSV-I 黏粒 DNA 黏粒克隆保存于一8〇°C 添加了 7 % 的 D M S O 的 S O B 培养基中。材料（标V 的条目参见附录1) H S V - I 黏性系列C 6Aa48A a 大肠杆菌克隆，包括黏性6A a ，黏性 1 4 , 黏性 2 8 , 黏性 48A a ，黏性 56 (图 12. 8. 1) V 含 5〇|ug/m l 氨苄青霉素的S O B 培养基（ S O B /a m p ) D M S O PlasmidMaxiKit (Qiagen)，包括 Qiagen-tip 500 柱，溶液 P l 、 P 2、 P 3、 Q B T 、 Q C 和 Q F (溶液Q F 提前预热至65°C ) 异丙醇 70% (V /V ) 乙醇 ■ VTE 溶液， p H 7. 5 、限制性内切核酸酶Dra I 、 1 和 Pac I 高分子质量的D N A 标准品（Life Technologies)

Ikb D N A ladder (Life Technologies) 电泳用的琼脂糖 V T A E 电泳缓冲液 l m g / m l 溴化乙键八25 : 24 : I (W V /V ) 苯酚/氯仿/异戊醇 25 : I (V /V ) 氯仿/异戊醇 1 0 0 % 乙醇 V 3mol/L 乙酸钠， p H 5. 5 I 7 I n m X l O O m m 无菌的带螺旋帽的管（如 F a l c o n 2 〇 5 9 ) SorvaU G S A 和 SS-34 转子 65°C和 37°C水浴箱 250m l 的高速离心管 30m l 离心管 1. 对于 H S V -I 黏性克隆系列 C 6Aa48A a 的每个黏性克隆，准备一含有 5m l 无菌的 SOB/a m p 培养基的17m m X 100m m 无菌的带螺旋帽的管。用接种环接种长期冻存的合适的黏性克隆。在 37°C 摇床中孵育8h。 2. 各转移Iml至一含有300m l 无菌S〇 B/a m p 培养基的2L 烧瓶中，在 37°C 摇床中再孵育 12〜16h。常常在白天预先培养 5m l ，扩大培养过夜。不要超过规定的將育次数。因为这样会增加黏粒变形的风险。同样的原因，避免菌落去除克隆。 3. 将菌液等分成I m l 置于低温冻存管，每管加人 7OfjJ D M S O 。混匀并长期保存于一80°C (可保存数年）。 4 . 将余下的菌液在2 5 0 m l 的高速离心管中离心沉淀， 4°C ， 4 0 0 0 g 离心 l O m i n 。 5•倒去培养基并将离心管倒置于纸上1〜2m i n 以吸干所有的液体。用 15ml P l 重悬沉淀后加入15ml P 2。旋转 6 次混匀，并在室温下孵育5min。 6. 加入 15ml P 3 , 立即旋转6 次混匀。将管子至于冰上孵育20min，再次旋转离心管。 4°C ， 16 OOOg 离心 30min。 7 . 同时，将 5 个 Qiagen-tip5 0 0 的柱子分别用10ml Q B T 平衡。在重力下流干液体。在柱上标记克隆名，并用一小片Kimwipe膜包住。 8. 将第 6 步中的上清小心地从膜中过滤至Qiagen-tip500的柱中，在重力下使液体通过树脂。 9. 用 30m l 的 Q C 洗柱2 次，然后用15m l 预热（65°C ) 的 Q F 洗脱 D N A ，液体置于一 30m l 离心管。 10. 用 0. 7 倍体积10. 5m i 的异丙醇沉淀D N A ，立即以20 000g ， 4°C 离心 10min。 11. 小心移去第10步中的上清且不弄坏沉淀，在管壁外标记沉淀位置。用冷却的70% 的乙醇洗涤沉淀，必要的话按照第10步的方法再次沉淀。 12. 完全吸去上清，但是避免沉淀过干。用20〇4 T E (p H 7. 5 ) 重悬沉淀，将 D N A 溶液转移至一小离心管，保存于4°C 。鉴定D N A 后，（测定浓度和限制性内切核酸酶酶切分析，第 13〜I4 步），分装成1〇〜5Ojug保存于一2〇°C 。

13.用紫外分光光度计测定第12步中的D N A 溶液在260n m (A 26。）和 280n m (A 280) 处的吸光值。在A 26。处的值I.O 相当于双链D N A 50jug/mlD 同时在A 26。和A 280的比率可表明 D N A 的纯度。比较纯的D N A 样品在A mo/A 28。的值为1.8，不要使用低于这一比率的D N A 样品。 14•同时可进行的反应，取第 12步所得的黏性D N A 2jug用限制性内切核酸酶Dra I ， I 各 I O U 在 37°C 酶切2h。在 T A E 电泳液中以40V 的电压，〇.4% 的琼脂糖胶电泳过夜以分离片段。用髙分子质量的D N A 和 Ikb D N A marker作为分子大小标准。用溴化乙锭染色，如图 12. 8. 2 所示来比较酶切片段类型。（0 . 4 % 的胶很软应小心处理)。 15. 将 5 种黏性D N A 各 IOjLig组合在一小專心管中，用限制性内切核酸酶p>aci 50U 配成总体积为IOCyl在 37°C酶切3h。用高分子质量的D N A 和 Ikb D N A marker作为分子大小标准。通过 0 . 4 % 的琼脂糖胶电泳1〜2^1反应混合物证实酶切完全（图 1 2. 8. 2)。 H S V -I 在黏性D N A 中的插入片段在唯一的P acX 限制酶切位点侧面。用 P ac 工酶切可以从黏性D N A 的骨架（约 7kb) 中释放H S V -I 插入片段（35〜40kb)，它可使克隆间的同源染色体在转染时更容易重组。 16. 抽提反应混合物，首先用IOOjuI (1体积）25 : 24 : I (V /V /V ) 的苯酚/氯仿/异戊醇，然后用l〇〇 /xl (1体积）24: I (V /V ) 的氯仿/异戊醇。加人 25(^1 (2. 5 体积） 1 0 0 % 乙醇和IOjlJ (0. 1 体积）的 3mol/L 的乙酸钠（ p H 5. 5 ) 沉淀D N A ，一20°C 孵育过夜。不要振荡，可用手指轻弹混匀以避免破坏大的D N A 片段。重要提示：由于D N A 将转染至哺乳动物细胞（基本方案），在无菌条件下处理以下操作。室温下将管子以20 OOOg的速率离心IOmin, 小心弃去上清液，用 7 0 % 的乙醇洗涤一遍。倒出乙醇，沉淀干燥lmin，用 IOOjlJ T E (p H 7. 5 ) 重悬（用最小的移液枪）沉淀。 18.按照第13步测量D N A 浓度。分装成IOjug保存于一2〇°C 备用。支持方案 2 扩增子的滴定提示：滴度与每毫升的转录单位数（t.u./ml) 是相关的。且不影响每毫升中的感染载体颗粒数。与转染效率相关的因素是： ①用于扩增的细胞数，②调解外源基因表达的启动子，③外源基因和④检测方法的敏感性。材料（标" V 的条目参见附录1) Vero (clone 76； E C A C C # 85020205), BFIK (clone 21； E C A C C ^ 85011433), 或 293 (ATCC #1573)细胞 DMEM (Life Technologies)添加 10%和 2% FBS (DMEM/10%FBS 和 DMEM/ 2%FBS)

P B S 从载体中收集来的样本（基本方案，第 9, Ila或 13b 步） 7 4 % (m /V ) 多聚甲醛溶液， PH 7.〇 V X -gal染色液， G S T 溶液或合适的一抗、二抗 24孔组织培养板潮湿的37°C， 5 % C O 2 培养箱倒置荧光显微镜倒置光学显微镜 1. 将细胞（如 Vero76、 BHK 2 1 或 293细胞）按照 I .OXlO5 的密度接种于2 4 孔板，加入 0. 5ml DMEM/10%FBS。孵育过夜。 2 . 吸去培养基，每孔均用P B S 洗，加入 0.1^x1， Ijul或 5 4 载体中收集来的样本，在 250jlJ D M E M /2% F B S 中稀释。 3. 孵育 1〜2d ，移去接种物。用 4 % 的多聚甲醛（ pH?. 0) 250p l 固定细胞。用 PB S洗涤固定的细胞2 或 3 次，然后按照检测操作方案根据转入的外源基因观察类似绿色荧光（第 4a 步）， X-gal染色（第 4b 步）或免疫细胞化学染色（第 4c〜6c 步）。检测绿色荧光基因的表达（ G F P ) 4a. 用倒置荧光显微镜观察第3 步（固定前后）中的细胞。数含绿色荧光细胞的个数，通过乘以外源基因表达细胞数和稀释倍数来确定载体的滴度。检测表达大肠杆菌 IacZ基因的细胞 4b•在第3 步中的24孔板中每孔加人250]LaX-gal，在 37°C下孵育4〜12h (取决于细胞类型和调节外源基因的表达的启动子）。 5b. 用 P B S 洗涤细胞3 次终止染色反应。用倒置光学显微镜数蓝色细胞数，通过乘以外源基因表达细胞数和稀释倍数来确定载体的滴度。通过免疫细胞化学染色的方法检测表达外源基因的细胞 4c. 在第 3 步中的24 孔板中每孔加入250/xlGST溶液（封闭非特异性结合位点和per_ meabilize细胞膜），室温下静置3〇 min。加含一抗的封闭液（用 G S T 溶液稀释）， 4°C孵育过夜。一抗可选的稀释范围由经验决定，一般为1/100〜]y l0000。 5c. 用 PBS洗涤细胞3 次，每次洗IOmin。加人二抗（用 G S T 溶液稀释），室温下孵育至少4h 。 6c. 用 P B S 洗涤细胞2 次，根据合适的显影操作规程显影。在倒置光学显微镜下数外源基因表达的细胞数，通过乘以外源基因表达细胞数和稀释倍数来确定载体的滴度。结合的二抗是商业化的。有关可选的稀释倍数和显影操作规程（取决于结合反应）由抗体公司提供。

来源：丁香实验

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