基本方案2 确定甲基化特异性 PCR 产物中 CpG 位点的甲基化

1.在 1.5 ml 管中加入 10ul MSP 产物。加入 15ul 10 X 限制性内切核酸酶和缓冲液，需要的话加 BSA，加水至 150ul。加入 10~20U 适合的限制性内切核酸酶。按照操作手册推荐的条件反应 4~6 h。

2.加入 1ul 10mg/ml 糖苷配糖基（作为载体）和 3 体积冰冻的 100% 的乙醇。-20°C，沉淀 DNA 几小时或过夜，离心 20 min，去上清，用冰冻的 70% 的乙醇清洗，离心 5 min，去上清液，干燥沉淀。加人 10~12ul 1 X 甲酰胺上样缓冲液溶解 DNA。

3.通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析（单元 7.2)。生成一幅预测的 PCR 产物的限制性酶谱用于估计消化片段的大小以及聚丙烯酰胺凝胶的浓度。跑胶时再把没消化的 PCR 产物点在消化的 PCR 产物旁边的泳道，对限制性酶谱进行比较。用溴化乙锭染胶，在 UV transiUuminator 观察并对胶进行拍照（附录 3G)。对条带谱进行分析，找到反映甲基化的序列差异。