扩增子转导滴定

扩增子转导滴定

材料

试剂

方法

接种 NIH-3T 3 细胞

1 • 根 据 滴 定 所 需 的 孔 数 ，预 温 足 够 的 含 5 % F B S 的 T E 和 D M E M 至 3 7 °C 。

2.在安全橱中，吸去细胞培养液。

3•用 5m l 无 C a2V M g 2+的 D P B S 清洗细胞。弃洗液。

4.用无 Ca2V M g 2+的 D P B S 按 I : 1 的比例稀释 T E 。在每个 N I H -3T 3 细胞的培养瓶中加 入 2m l 稀释的 T E 。

5.室温或 37°C 孵育细胞，直至其完全脱落。每 5m in 观察一次，轻轻晃动使细胞脱落。

6.在脱落的细胞中加入约 I O m l 含 5 % F B S 的 D M E M 。用移液器轻轻吹打以悬浮细胞。

7•在 15m l 的锥形管中，将 〇.5m l 的悬浮细胞加人 4.5m l 的培养液中。吹打以悬浮细胞。

8.加 约 IOuI 的悬浮液到红血球计数板上。

9•计算计数板两边 4m m 2 方 格（栅格的四角）中细胞的数量。计算每平方毫米方格中的平均细胞数。乘以稀释倍数。将结果再乘以 IO⁴。得到的结果表示在原细胞悬液中每毫升的细胞数。

10.根据细胞计数的结果，用预温的培养液将细胞稀释到最终浓度为 2 X 10⁵ 个/m l 。吹打以混匀。

11.在 24 孔板的每个孔中加人〇 • 5m l 含 5 % F B S 的 D M E M 。

12•用 5m l 的移液器，每个孔中加〇.5m l 的稀释后细胞液，使最终浓度为每孔 I X I O ⁵个细胞。

13.37°C 将培养板孵育过夜。转导 .

14.将 Iul 和 5ul 待滴定的扩增子病毒储存液稀释在 350m l 预温的含 5 % F B S 的 D M E M培养液中。振荡每管约 Is。

15.在安全橱中，吸出细胞培养液。加人备好的病毒悬液。

16.将培养板 37°C 解 育 l h。每 15m i n 轻轻旋转平板，使病毒均匀分散。

17.在安全橱中，每个孔中加人 400M 1 含预温 5 % F B S 的 D M E M 培养液。

18•将培养板 37°C 孵 育 20〜24 h 。

裂解并消化转导后的细胞

19.当细胞形成单层后，吸出培养基。

20.每 孔 加 入 1(%1 含 l m m o l /L D T T 的裂解缓冲液。室温孵育 15m i n 。

21.将裂解液转到 I.7m l 的离心管中。

22.每管加人 IOOuI 含 〇.2m g /m l 蛋白酶 K 的 2X 消化缓冲液。 56-C 孵育 3 h 。

苯酚/氯仿抽提

23•用氯仿：异戊醇混合液按 I : 1 的比例稀释饱和的苯酚溶液。每管中加人 200ul 苯酚 ：氯 仿 ：异戊醇混合液。颠 倒 10 次以充分混匀。

24.13 OOOg■离心 5m i n 。

25•小心吸出水（上）层 ，转移到新的 1.7m l 离心管中。数。