A A V 血清型载体的构建

A A V 血清型载体的构建

材料

试剂

benzonase 核 酸 酶（S g m a -A ld ric h )

细 胞 ：人 类 胚 胎 肾 细 胞 2 兕（A T C C )

氯 化 铯（Sigma-Aldrich)

加 有 1 0 % 胎 牛 血 清 和 1 % 青 霉 素 / 链 霉 素 的 D M E M 培 养 基（Sigm a-A ldrich)

溶 于 双 蒸 馏 水 的 亮 肽 素 Geupeptin) (3p g /m l) (Sigm a-A ld rich )

无 C a2V M g 2+的磷酸盐缓冲液（P B S ) (Sigma-Aldridi)

质粒

A A V 血清型帮助质粒（如 p X R l 、 p X R 2、 p X R 3、 p X R 4 和 p X R 5; U N C 载体核心）

腺病毒帮助质粒（如 P X X 6-80; U N C 载体核心）

A A V 转基因包装框（如 p T R -C M V -G F P ; U N C 载体核心）

Superfect 转染试剂盒（Q I A G E N )

T ry p sin -E D T A (Sigm a-A ld rich )

仪器

离心和超速离心系统（Sorvall R T 6000B )

离 心 管（16m m X 76m m ) (Beckman polyallomer Quick-Seal)

透 析 卡（Pierce Slide-A -L yz er) ( 10 OOOkDa m. w. cutoff)

超声波破碎机（3m m 探针）

带 有 T L N l O O 转头的超速离心机（B e c k m a n Optima T L X )

方法

1•用胰酶消化 15c m 板上汇合的 H E K 293 细 胞（约 2X 10⁷ 个)。按 I : 3 的比例用培养基稀释。重新接种并过夜。

2•根据制造商的说明，用 Superfect 转染试剂盒，每 块 板（共 5〜1 0 块）转 染 7 ug 的p T R -C M V - G F P (转基因包装框)、 15 坪 的 P X X 6-80 (腺病毒帮助质粒）和 IOug 的A A V 血清型帮助质粒（p X R l 〜PX R 5)。

3 . 转染后 48〜5 0 h 用细胞刮收获细胞。除有特别规定外，所有以下的操作在冰上进行。

4.1000r/min (Sorvall R T 6000B ) 离心细胞。用亮肽素重悬。

5•在 duty 设 为 50% ， output control setting 设 为 2 的条件下，用 25 bursts 超声波破碎细胞。

6.lOOOr/min 离心，除去细胞碎片。

7•加 benzonase 核酸酶至最终浓度为 I.2U /ul。

8.37°C |浮育 30〜60m i n 。

9•每毫升裂解液中加〇 • 6 g 氯化铯。将悬液转移到 B e c k m a n 管内。

1 0 . 用 带 T L N 1 0 0 转头的 Beckm an Optima T L X 超速离心机，将混合液 10 0 000r/m in离心 4 h 。

11•用使用放射性标记的探针（G F P 转基因）的斑点杂交确定梯度中的最高洗脱峰。

12•在冰室中，使 用 Pierce 透析卡，用 P B S 过夜透析洗脱峰，然后测定病毒滴度（每毫升载体基因的数量）。

通过核衣壳移植构建嵌合载体

方法

1 . 用胰酶消化 15 c m 板上汇合的 H E K 2 9 3 细 胞（约 2 X 10⁷ 个)。按 i : 3 的比例用培养基稀释。重新接种并过夜。

2.根据制造商的说明，用 Superfect 转染试剂盒，每 块 板（共 5〜1 0 块）转 染 7 ug 的pTR-CMV-GFP (转基因包装框）、 15ug 的 P X X 6-80 (腺病毒帮助质粒）和 1 〇 ug 的混合 A A V 血清型帮助质粒（p X R l -5)。

为 了 构 建 有 不 同 血 清 型 组 分 的 A A V 病 毒 颗 粒 ，每 种 转 染 的 A A V 血 清 型 帮 助 质 粒 的 数 量 要根 据 估 计 的 比 例 变 化 。例 如 ，如 果 希 望 A A V l 和 A A V 2 按 19 : 1 的 比 例 混 合 ，则 在 转 染 混合 物 中 要 加 人 9. 5 吨 的 p X R l 和 〇. 5ug 的 pXR2。

3•以下的步骤可按方案 1 中的步骤 3〜12 进行。

通过标记拯救构建镶嵌型质粒

材料

试剂

Benzonase 核 酸 酶（Sigm a-A ldrich)

细 胞 ： H e L a 细 胞（A T C C ) 或 其 他 用 于 选 择 / 循 环 的 目 标 细 胞 类 型 和 H E K 2 9 3 细胞（A T C C )

氯 化 铯（Sigma-Aldrich)

加 有 10% 胎 牛 血 清 和 1 % 青 霉 素 / 链 霉 素 的 D M E M 培 养 基（Sigma-Aldrich)

亮 肽 素（Ieupeptin) (3ug/ml) (Sgma-Aldrich)

磷酸盐缓冲液（PBS) (Sigma-Aldrich)

质 粒

A A V 帮 助 穿 梭 质 粒（如 P X R 2 A N )

这里所用的 P X R 2A N 穿梭质粒在衣壳基因的起始处有一个单一的 A / « I 位点，在衣壳基因末端有一个单一的 N 〇 iI 位点。 这样方便于将所有的 P C R 产物直接克隆到 A A V 帮助质粒上 ，从而进行测序和载体构建。

A A V 血 清 型 帮 助 质 粒（如 p X R l、 p X R 2 、 PX R 3 、 p X R 4 和 p X R 5 ; U N C 载体核 心）

腺 病 毒 帮 助 质 粒（如 pX X 6-80; U N C 载 体 核 心）

A A V 转 基 因 包 装 框（如 p T R -C M V -G F P ; U N C 载 体 核 心）

有 R e p 、 C a p 和 I T R 区 的 A A V 血 清 型 质 粒（U N C 载 体 核 心）

所 需 的 突 变 型 A A V 血 清 型 质 粒（如 H / N 3 7 6 1 无 感 染 性 的 A A V 2 突 变 体）

用 于 扩 增 A A V 血 清 型 C a p 蛋 白 P C R 片 段 的 引 物（如 A A V 3 b )

Superfect 转 染 试 剂 盒（Q IA G E N )

Trypsin-EDTA (Sigma-Aldrich)

病 毒 ：腺 病 毒 沿 309 ( U N C 载 体 核 心）

仪器

构 建 镶 嵌 载 体 所 需 的 材 料 和 设 备 与 方 案 1 中 的 一 样 。

方法

1•用 P m I I 消 化 H /N 3761 A A V 2 突变型质粒。

2 . 将大约 IO6 个 H E K 293 细胞均匀接种到 6 cm 板上。

3.根据制造商的说明，用 Superfect 转染试剂盒，用 lM g 经过消化的 H /N 3761 A A V 2突变型质粒和 Ipg A A V 3b P C R 片段转染细胞。

4 . 转染后，立即用 4 倍感染复数的腺病毒沿 309 转 染 293 细胞。让病毒吸附 l h。

5.用 5m l 新鲜培养基换掉含有病毒的培养基。

6 .转染后 48〜60 h 用细胞刮收获细胞。

除 有 特 别 规 定 外 ，所 有 以 下 的 操 作 在 冰 上 进 行 。

7.1000r/min 离心细胞。（SorvallRT 6000B) 。

8 . 用 PBS 重悬细胞，反复冻融 3 次使细胞释放病毒。

9•将裂解液在 56°C 孵 育 30m i n ，使腺病毒失活。

10.将 IOOm I 裂解液加入到含有 4 倍感染复数腺病毒沿 309 的 HeLa 细胞中。

根 据 不 同 的 研 究 需 要 ，可 以 换 用 其 他 的 细 胞 类 型 。

11.重复步骤 5〜10。

12•每次循环后，对病毒感染的细胞裂解液进行斑点杂交，确认产生了能存活的细胞类型特异性镶嵌颗粒。

13.用 P C R 分析来确定循环中得到的镶嵌颗粒的基因序列。

14•为了测定重组型 A A V 的产量，按方案 1， 用 质 粒 pTR-CMV-GFP、 PXX6-80 和 镶嵌 型 A A V 帮助质粒进行三质粒转染。