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        端 粒 长 度 和 端 粒 酶 活 性 的 分 析

        相关实验：分子生物学实验

        最新修订时间：

        材料与仪器

        步骤

         

        基 本 方 案 I Southern 杂 交 检 测 传 统 凝 胶 电 泳 中 末 端 端 粒 D N A 限制性片段(TRF) 的端粒长度

        材 料

        基 因 组 D N A (试剂盒分离）

        和 限 制 性 内 切 核 酸 酶 和 反 应 缓 冲 液
        琼 脂 糖（D N A 级）

        1 〇 X T B E 或 T A E
        6 X D N A 上样缓冲液

        I k b 间隔的 D N A 梯度条带

        l O m g /m l 溴化乙锭

        变性缓冲液

        T E

        中和溶液

        Q u i c k H y b 杂交溶液

        γ 32P -(C C C T A A )4 末端标记端粒探针（见辅助方案 1)

        加入 0.1% (m /V ) S D S 的 5 X 和 2 X S S C

        四 甲 基 氯 化 铵（T M A C l )

        凝胶电泳设备和电源

        紫外光和相机

        刹刀片

        3M M 纸

        塑料膜

        干胶仪或相应设备

        振荡平板

        玻璃杂交管

        杂交炉或 43°C水浴

        磷光显像系统或相应设备

        图像分析软件

        1 . 按标准步骤从细胞或组织中分离基因组 D N A 。

        2 . 用Hinfi和 RasI限 制 性 内 切 核 酸 酶 各 自 10〜50U 消 化 1〜5ug g D N A ，总 体 积 50〜100ul， 37°C 孵育至少 4 h 或过夜。荧光仪检测消化的 D N A 浓度，或溴化乙锭点测验(见 C P I 附 录 3L )
        对 大 体 积 的 消 化 反 应 和 （或 ） 高 浓 度 的 D N A 和 酶 ， 用 苯 酚 / 氯 仿 / 异 丙 醇 25: 24 : I (W V 7 T O 抽 提 消 化 的 D N A 和 乙 醇 沉 淀 。 用 T E 重 悬 消 化 的 D N A 至 0• 1〜 0• 2jug/fxl〇 3 . 用 I X T B E 或 I X T A E 制 备 0 . 6 % 琼脂糖胶。每 孔 加 入 1〜2/x g 每个消化的 D N A 样 品 和 6 X D N A 的上样缓冲混合液。一 孔 加 入 D N A 分 子 标 记 （1〜40k b )。制备充足 的 I X T B E 或 I X T A E 电 泳 缓 冲 液 （使用与琼脂糖胶相同的缓冲液），含 0. 5M g/ml 溴化乙锭。恒压电泳： 75V ， 30m i n ， 35V ， 24〜30h 和 75V ， l h 。 4 . 电泳完全后，在紫外线下拍照，拍照时放入尺子比对。 5 . 用剃刀片修掉胶的不用区域，将胶放 在 一 片 3M M 纸上 ，覆盖塑料膜， 65°C真空干 燥 1〜2h 。干胶与正面向上的3M M 纸一起浸泡在200m l 变性溶液中，室 温 轻 摇 l h 。 移去溶液和3M M 纸 ， 100ml T E 洗胶。换 成 200m l 中和溶液，摇 30m i n ，重复一次。 6 . 将 胶 放 置 在一个玻璃管中，用 15〜20ml Q u i k H y b 杂 交 溶 液 43°C预 杂 交 l h 。加 0.5X 106〜1.5X IO6 cp m / p m o l Y32P -(C C C T A A )4末 端 标 记 端 粒 探 针 （见辅助方案 1)， 45°C旋转过夜。 7 . 弃含有未结合的Y32P -(C C C T A A )4末端标记端粒探针的杂交溶液， 25ml 5 X S S C / 0.1% S D S 简略洗胶。弃 5 X S S C /0. 1% S D S 并又加入 25m l 5 X S S C / 0 . 1 % S D S 。将管 放入杂交炉， 40°C 旋转 30m i n 。弃 5 X S S C /0. 1% S D S 并加入 25m l 2 X S S C /0.1% 303管放入杂交炉中40°(：旋转 3〇 111丨 11。弃 2 \ 3 3 0 / 0 . 1 % 3 0 3 ，加入251111丁“八 0洗 液 。管放入杂交炉中44°C 旋 转 30m i n D 8 . 从玻璃管中小心移出胶，放在纸塔上完全吸去液体，用塑料膜包裹胶，并用磷光屏 或胶片曝光。磷光成像仪采集自显影图片，分 辨 率 50〜100M m ，或冲洗胶片并用光 密度计转换成电子图片。 9 . 利用从上样孔的迁移距离对D N A ladder (2〜30k b) 作图。 10. 点击分析软件对象工具条上的“line”按钮在目的泳道上画一条线： 将光标放置在 上样孔上，按住拖动光标到泳道中央，当到达D N A 分子标记3k b 处放开鼠标按键。 依据分析创建线图。 11. 输出依据直线测量的密度：点击鼠标右键，选 择 C o p y 。打开一个Excel表格，粘贴 包含每一个从上样孔到3k b 的相应位置的密度数据。按 照 D N A 分子标记迁移将迁 移 距 离 （m m ) 转 成 D N A 大小。 12. 按公式计算平均T R F 长度： ¥J^ TFR (kb)=^ f c 式中， I a 是 输 出 的 密 度 （任意节）； S z是在 i k b 位置上 T R F D N A 片段的大小。估 算平均端粒长度。 备 选 方 案 1 尼 龙 膜 上 的Southern杂交 附 加 材 料 （其 他 材料 见基 本 方案 1 ， 带V 项 目 见 附 录 1) 尼龙膜
        碱性转移缓冲液 毛细转移系统 紫外照射或真空炉 1 . 从细胞或组织分离基因组D N A ，消 化 D N A ，按基本方案1 步 骤 1〜4 进行凝胶电泳。 2 . 用剃刀片修掉不用的胶，置 于 一 个 盘 中 用 200m l 变 性 溶 液 持 续 轻 轻 搅 拌 45m i n ， 100ml T E 略微清洗， 200m l 中和溶液持续搅拌30m i n ，两次 。将胶浸入碱性转移缓 冲液中室温15m i n ，持续轻柔搅拌。 3•用毛细或其他转移法从琼脂糖胶转移D N A 到 尼 龙 膜 （最好向下转移）。用紫外照射 或在真空炉中烘干将D N A 固定在尼龙膜上。接下来的预杂交、杂交和后续步骤按照 基本方案1，步 骤 6〜7。 4 . 用塑料膜包裹尼龙膜，用磷光屏或胶片曝光。按照基本方案1 ，步 骤 8〜12。 辅 助 方 案 1 端粒或其他寡聚核苷酸末端标记 材料 lOpmol/jul (1(1'丁八0 0 0 )4端 粒寡聚核苷酸 6000C i/mmol [y-32P ] A T P T 4 噬菌体多聚核苷酸激酶和I O X 缓冲液 200M 1微量离心管 离心柱 液闪仪 1 . 将以下试剂在200m 1微量离心管中混合： 1M1 I O p m o l V 粒寡聚核苷酸 5jul 6000C i/mmol [y-32P ] A T P 2M1 10X T 4 噬菌体多聚核苷酸激酶缓冲液 11.4/xl蒸馏水 Im I (I O U ) T 4 噬菌体多聚核苷酸激酶 37°C 孵 育 l h 。 65°C 孵 育 5m i n 灭 活 T 4 噻菌体多聚核苷酸激酶。 2 . 离心柱移除未掺入的A T P 。 3 . 用液闪仪测定特异标记的寡聚核苷酸（使 用 1/xl探针用于分析）。 基 本 方 案 2 用脉冲电场凝胶电泳法测量端粒 P F G E 被 普 遍 用 于 测 量 长 的 小 鼠 端 粒 （25k b 到 大 于 50k b )，也用于人类端粒的 测量。 材 料 （带V 项 目 见 附 录 1) 淋巴细胞的单细胞悬液 V P B S V 细胞悬浮缓冲液
        0.5 X T B E 配制 1.2% InCert 琼脂糖，一45°C V 蛋 白 酶 K 缓冲液 V 洗涤缓冲液I 苯甲基磺酰氟化物（P M S F 溶液， 100m m 〇l/L ) 缓 冲 液 A 中溶解H f n H 和 i^ a l 限制性内切核酸酶 0 •5 X T B E 0.5 X T B E 配 制 1% 超纯琼脂糖 小分子质量P F G 分 子 质 量 标 记 （嵌入琼脂糖胶中的194〜2k b 分子标记） 溴化乙锭 变性溶液 V T E 中和溶液 Q u i c k H y b 溶液 / 2P -(C C C T A A )4末 端 标记端粒探针（见辅助方案1) V 加入 〇 .l % S D S O n A O 的 5 X 和 2 X S S C 1.5m l 微量离心管，去 除 D N A 酶 可重复使用的塞子模型 胶带 15ml 管 杂交炉或水浴 平板摇床 脉冲电场凝胶电泳设备 "Waterman 3M M 纸 真空干胶仪 杂交管 磷光成像系统 ImageQuant (或相应设备）分析软件 1•制备淋巴细胞的单细胞悬液， 15ml P B S 洗细胞一次，室温， 300g 离 心 7m i n ，计数。 2•转移5 X 106〜50X 106个细胞到一个1.5m l 的微量离心管中，室 温 ， 1600g 微量离心 2m i n 。弃上清，用 0.5m l 细胞悬浮缓冲液重悬沉淀。充分混合。 小 鼠 端 粒 比 较 短 （< 1 5 k b ) ， 如 果 用 相 同 数 目 的 细 胞 ，端 粒 探 针 会 产 生 较 弱 的 信 号 。 3 . 用胶布将塞子模型的底部密封。将 等 体 积 的 1.2% InCert琼脂糖加入细胞悬液中。 用移液器充分混合细胞和琼脂糖。用 一 宽 孔 枪 头 转 移 细 胞 琼 脂 糖 混 合 物 （约 IOOm I 液体， 0.5X 106〜5 X 106个细胞）到密封好的模型中， 4°C 冷 却 15m i n 。 4 . 琼脂糖在塞子模型中凝固后，从底部移去胶带，折断模型的一端，将每个塞子挤出 放入一个15m l 管中。每管加入5m l 蛋 白 酶 K 缓冲液， 45°C 孵 育 20h 。 5 . 去除蛋白酶K 溶液 ，加 入 5m l 洗涤缓冲液I，平板摇床上室温轻摇管15m i n 。重复本 步骤一次
        6 . 将塞子放入5m l 新 加 入 l m m o l /L P M S F 的洗涤缓冲液I 中， 37°C 孵 育 I h 以去除残 留的蛋白酶K (见步 骤 5)。将塞子浸没在用水稀释1 0 倍 的 洗 涤 缓 冲 液 I 中， 4°C 储 存至使用时。 7 . 转移一个琼脂糖塞子到1.5m l 微量离心管中，将塞子浸没在400W 缓 冲 液 A 中，室 温 孵 育 15m i n 。移 去 缓 冲 液 A ，加 入 250|u l含 有 100U H f n f I 和 i^ a l 的 缓 冲 液 A 。 37°C 孵 育 8h 或过夜。移去酶/缓冲液，用 500M 10.5X T B E 洗塞子以终止消化。 端 粒 D N A 和 大 多 亚 端 粒 D N A 对 这 些 酶 的 消 化 不 敏 感 ，但 非 端 粒 D N A 敏 感 。 8 . 用 0.5X T B E 配 制 1 % 琼脂糖凝胶。用与特异脉冲电场电泳系统相合适的胶盒和梳 子 。胶凝固后，移去梳子，胶中插入一个塞子/孔 。在至少一个孔中加入合适的分子 质量标记。 9 . 将上样胶放入脉冲电场胶盒中，加 0.5 X T B E 电泳缓冲液。按照手册推荐的条件溶 解端粒，分 离 5〜I O O k b 的 D N A 。用溴化乙锭染胶，用尺子放在胶旁比对拍照，以 方便后续 T R F 长度的测量。 10. 将胶放在一张3M M 纸上， 65°C 真 空 干 燥 1〜1.5h 。用端粒探针与干胶杂交，或用 塑料膜包裹，室温储藏。 11. 干胶与正面向上的3M M 纸 一 起 浸 泡 在 200m l 变性溶液中，室 温 轻 摇 l h 。倒掉溶 液 ， 100ml T E 洗胶。将 胶 浸 入 200m l 中和溶液中，室 温 轻 摇 30m i n 。重复用中和 溶液孵育一次。 1 2 . 将胶放入有20ml Q u i k H y b 溶液的杂交管中，在杂交炉中50°C旋 转 15〜30 m i n。 在 含有预杂交胶的管中加入〇• 5 X IO6〜I.5 X IO6 c p m / p m o l 末 端 标 记 端 粒 探 针 （见辅 助 方 案 1)，在杂交炉中50°C 旋转至少5h 或过夜。 13. 弃杂交溶液，用 25〇 115\330/0.1%808简 略 洗 胶 。弃 5\33〇 /0.1%303并 又 加 入 25m l 5 X S S C /0. 1 % S D S 。将管放入杂交炉， 48°C 旋转 30m i n 。弃 5 X S S C /0.1% S D S 并 加 入 25ml 2 X S S C /0. 1 % S D S 。管放入杂交炉中48°C 旋转孵育30m i n 。 14. 从玻璃管中小心移出胶，放在纸塔上完全吸干，用塑料膜包裹胶，并用磷光屏曝 光 。磷光成像仪采集自显影图片，分 辨 率 50M m 。 1 5 . 既可以用传统胶片也可以用带有I m a g e Q u n t 软件的磷光成像系统来观察端粒并且估 计端粒长度分布。 基本方案3 荧光原位杂交 材 料 （带 V 项 目 见 附 录 1) 淋巴细胞单细胞悬液 V P B S V 预洗缓冲液 n/ 杂交缓冲液I n/ P N A 端粒探针：（P N A ) F T r C -(C C C T A A )4 V 洗涤缓冲液 II V 洗涤缓冲液III
        重悬浮缓冲液 低 密 度 F I T C 偶 联 的 24号 标 准 微 珠 （3&1^3 1^1)〇 1^1:〇 1^3) 任意 D N A 染 料 （Exciton 公司的 L D S 751; Sigma 公司的 propidium iodide) 去 D N a s e 的 I.5m l 离心管 加热器，加热块或者水浴锅 12m m X 75m m 的流式管 Nitex尼龙网 流式细胞仪 分 析 软 件 （CellQiiest或者其他） 1 . 制备淋巴细胞的单细胞悬液，用 15ml P B S 洗一遍，室温 ， 300 ^ 离 心 7m i n ，然后细 胞 计 数 （附 录 3A ) 。 取 I X l O 6个细胞来确定F S C 和 S S C 选择框。 2 . 可选：为了控制每天实验杂交效率的变化，需要包括一群对照细胞，并且在每一次 实 验 中 细 胞 要 保 持 固 定 不 变 的 端 粒 长 度 （如 培 养 的 E L -4、 K 6 5 2 等肿瘤细胞或者 D a u d i 或者淋巴细胞如外周淋巴细胞应来自同一个供体）。用 P B S 洗一遍然后计数 (附录3A )。 3 . 将剩下的细胞室温， 300g 离 心 7m i n ，弃去上清。用 1〜2m l 预洗缓冲液重悬浮细胞 沉淀，室温至少孵育30m i n 。 4 . 每一个样本将最多3 X 105个细胞转移到至少4 管新的离心管中。 1600g 瞬时离心沉 淀细胞，吸去上清然后温和振荡重悬浮细胞。在两管离心管中加入300/xl含 有 F I T C 偶联的端粒探针的杂交缓存液I，往 剩 余 管 中 加 入 3 0 0 4 不 含 探 针 的 杂 交 缓 冲 液 I (自发荧光对照）。所 有 管 子 室 温 避 光 孵 育 15m i n ，将 管 子 放 入 加 热 器 86°C 避光孵 育 15m i n 〇 5 . 从加热器中取出后将管子室温避光继续孵育60〜90m i n 。 6. 1600g 离 心 5m i n 洗去未结合探针，倒掉或者用吸引器吸去多余上清，只保留大约 100/xl液体。用手轻弹离心管重悬浮细胞（不要用振荡器），加 入 I m l 洗涤缓冲液II， 用洗涤缓冲液II重 复 洗 4 遍 。 7 . 洗后吸去上清，只 保 留 50M 1液体，轻弹离心管重悬浮细胞。加 入 I m l 洗涤缓冲液III 温和颠倒管子1 或 2 次悬浮细胞， 950g 离 心 5miri。 8 . 洗后吸去上清，只 保 留 50|ul液体。用 250^1重悬浮缓冲液，有需要的可以将细胞悬 液 通 过 Nitex尼龙网滤去较大的细胞团块，然后将细胞悬液转移到12m m X 75m m 流 式管中。至少室温避光放置20m i n ， 48h 内上机分析。 虽然很多实验室都有现成的P I 染料，但在本实验方案中由于P I 可 与 F I T C 偶联 的端粒相互干扰，所 以 L D S 7 5 1 更 适 合 用 来 做 D N A 染色。不过，用亚饱和浓度的 P I ，并且如果每管都有相同数量的细胞，则可以最低限度的降低这个问题。 9 . 得 到 的 数 据 ，可 用 线 性 分 析 处 理 F S C 、 S S C 和 F L 3 (L D S 7 5 1 或 者 PI) ，而 FL l (F I T C 偶联的端粒）既可用线性分析也可用对数分析。 线性分析相对于对数分析对于不同细胞群之间微小的焚光强度的差异敏感性 更高。 10. 可选：使用低密度F I T C 偶 联 的 2 4 号标准微珠来设置F L l 通道标准化得到的数据
        调整电压和幅度是得到的数据有线性设置，未标记微珠和4 个 F L l 通道中检测到的 F I T C 标记微珠的荧光强度峰值与通道数目一致。记录得到的电压和幅度，保存文 件 。接下来的实验，调 整 F L l 的电压和幅度使得4 个 F I T C 标记微珠群的峰值通道 数目在每一次实验中都是相同的。 11. 用一管活细胞在F S C 和 S S C 通道中标记活细胞群体，保存对照组样本数据。用 24 号微珠作为最后的样品来确认流式仪没有发生偏移。 12. 用 CellQuest或者其他软件来分析流式数据。通过在 F S C 和 S S C 通道来分选端粒特 异性标记的细胞，并 通 过 F S C 和 L D S 751/P I 通道来分选单个非分裂细胞来进行分 析 ，画柱状图并且算出平均通道数目。用以下方法来计算每种样本的端粒特异性标 记数目。 a. 直接从平均F L l 通道数目来计算端粒特异性标记：端粒特异性标记$^ « @ =端 粒 探 针 标 记 数 — 自 发 荧 光 数 。用检测每天探针杂交效率的对照细胞的标 记数对得到的数据进行标准化。 b•用Bangs Laboratories提供的软件画出每群F I T C 标记微珠记录的平均通道数和 每群微珠特异M E S F 值之间的曲线关系。用线性回归法从该曲线上的F L l 通道 数推算出每个样品管子的M E S F 。计算端粒特异性标记数（用 M E S F 单位）：端 粒特异性标记MESP = 端粒探针标记MESF — 自发突光数MESF。 F I S H 实 验 中 出 现 的 常 见 问 题 见 表 14. 10. 1 。 表 14.10. I FISH 分析的问题解决方法 问题 可能原因及解决方法 FL O W -FISH 较差的复制重复性 得到用于分析的细胞太少 每次不同的杂交效率 Q -FISH 没有分裂中期涂片或者涂片质量较差 较差的杂交重复性 每次不同的杂交效率 杂交缓冲液没有完全混匀 由于细胞比较脆弱，处理的时候需要小心仔细 用 FTTC标记的微珠和对照细胞群来进行标准化 调整最适条件—秋水仙素处理不同时间 杂交缓冲液没有完全混勻 用 Cy3标记的微珠和对照分裂中期涂片标准化 基本方案4 Q FISH 材 料 （带 V 项 目 见 附 录 1) 分 裂 中 期 涂 片 （见辅助方案2) n/ P B S , p H 7. 5 n/ 4 % (V T V r) 甲醛 V 胃蛋白酶， 37°C 7 0 % ， 9 0 % ， 100% (V /V ) 乙醇 V P N A 端 粒 探 针 ： （PN A)Cy3-(CCCTAA)3 V 杂交缓冲液
        洗涤缓冲液I V V T B S T 缓冲液 TetraSpeck突光标记中心体样品试剂盒（分子探针），选用 V DAPI-Vectashield 染料 20m m X 50m m 盖玻片 玻璃染色盘 摇床 用铝箔纸包被的湿润的载玻片 用来存放载玻片的卡纸板夹 荧光显微镜 注 ：下列所有实验步骤除了胃蛋白酶处理以外，其余均在室温的摇床上进行。所有 的洗涤步骤都是把载玻片放在玻璃染色盘中然后加入足够量的洗液覆盖载玻片。在载玻 片暴露在探针中后应用铝箔纸包裹染色盘避光保护。 1 . 在玻璃载玻片上用分裂细胞制作分裂中期涂片（见辅助 方 案 2)。如果涂片已经开始 脱水，重 新 用 P B S 洗载玻片5〜15m i n 。将涂片用4 % 甲醛固定2m i n 。 2. P B S 洗载玻片3 次 ，每 次 5mirx。 3 . 用胃蛋白酶37°C 处理载玻片IOmiri以消化蛋白质， P B S 洗 2 次 ，每 次 5m i n 。 4. 4 % 甲醛固定玻片2m i n ， P B S 洗 3 次 ，每 次 5m i n 。 5 . 脱水：用 7 0 % 乙 醇 处 理 5min， 然 后 9 0 % 乙 醇 处 理 5min ， 最 后 用 无 水 乙 醇 处 理 5min， 短暂的风干玻片。 6 . 滴 30/xl含端粒探针的杂交缓冲液II到一个 24m m X 50m m 的盖玻片上。 7 . 将玻片80°C 右侧向上孵育3m i n 使端粒变性并且与探针杂交，玻片平放然后右侧向上 放入湿润的玻片盒中，用铝箔纸包裹避光，室温孵育2h 。 8 . 用洗涤缓冲液I V 洗 2 次 ，每 次 15m i n 。然 后 用 T B S T 缓冲液洗3 次 ，每 次 5m i n 。 9 . 脱水：用 7 0 % 乙 醇 处 理 5m i n ，然 后 9 0 % 乙 醇 处 理 5m i n ，最 后 用 无 水 乙 醇 处 理 5m i n ，短暂的风干玻片。 10. 可选：通过荧光标记珠子标准化各个实验之间的突光信号。将 2〜5jul TetraSpeck 珠 子 （0.5M m ) 以 1 : 5 0 比例稀释于无水乙醇中，然后涂在不含分裂中期涂片的玻 片上，使珠子在玻片上干燥。滴 40；xl DAPI-Vectashiedl染 剂到一块24m m X 50m m 盖玻片上，将载玻片从上往下放到杂交缓冲液II的液滴上，然后将盖有盖玻片的载 玻片翻过来。玻片平放在载玻片保存盒中4°C 避光。 11. 用配备有广泛视野的荧光成像显微镜获取D A P I 和 C y3 的图像。 12. 获取图像并且保存原始数据为1 6 位 T I F F 格式文件，因 为 T F L - T E L O 端粒分析软 件只接受8 位数据文件，连续扫描1 6 位原始文件然后输出并保存为8 位 T I F F 文件 用来分析，特 别 是 C y 3 端粒图像。 13. 用 T F L - T E L O 端粒分析软件定量C y 3 端粒标记
        辅助方案2 从分裂的淋巴细胞中制备分裂中期染色体 材 料 淋巴细胞 促有丝分裂刺激剂 10/xg/m l 秋水仙素 0. 075mol/l KC1, 37°C 3 : I (V A O 甲醇/乙酸，新鲜配制 7 0 % ， 9 0 % 和 1 0 0 % ( V W ) 乙醇 5 0 m l 和 1 5 m l 离心管 离心机 振荡器 Parafilm 封口膜 2 5 m m X 7 5 m m X I m m 载玻片 1 . 培养的淋巴细胞用丝裂原刺激48h ，诱 导 其 增 殖 （见第二章单元2. 7 B 细胞刺激和第 二章单元2. 11 T 细胞刺激） 2•加入10/xg/ml秋 水 仙 素 （终 浓 度 为 0.1/jtg/ml)至培养基中， 37°C培 养 30 m i n〜3 h 。 将细胞转移入5 0 m l 离心管，室 温 ， 300g•离心7 m i n 。 吸掉大部分培养基，留 5 m l 。 剧烈的反复吹吸或涡旋振荡，使细胞完全悬浮。 3 . 边逐滴加入1011110.075111〇1/1^1〇：1，边轻微的涡旋振荡。用1<： (：1装满离心管， 37°〇 孵 育 l h 。加 入 3〜5 滴 3: I (V /V ) 甲醇/乙 酸 （液体会变成黄色），颠倒混匀。室 温 ， 300g 离 心 lO m i n。吸掉大部分培养基，留 5m l 。手指用力弹管壁，悬浮细胞。 用 3 : 1 (V /V ) 甲醇/乙酸装满离心管，室温， 300g 离 心 lOmin。 4 . 将细胞转移进1 5 m l 离心管。用 3: I ( W V ) 甲醇/乙酸装满离心管，室温， 3 0 0 g 离 心 lO m i n。 吸掉大部分培养基，留 l m l 。 手指用力弹管壁，悬浮细胞。用 3 : I ( W V O 甲醇/乙酸装满离心管，室温， 3 0 0 g 离 心 lOmin。 重复两次。 5 . 洗完最后一遍后，用小体积的3: I (V 7 V ) 甲醇/乙酸悬浮细胞。如果不做涂片，则 用封口膜将离心管封闭，于一20°C可保存 6 个月。保存于一20°C的细胞用3 : 1 ( V A O 甲醇/乙酸洗一遍后可进人下一步。 6 . 将 2 5 m m X 7 5 m m X l m m 的载玻片45""角放置。滴 加 15//1的细胞悬浮液于载玻片上。 待液体蒸发完后，在显微镜下观察有丝分裂中间期。必要时可调整3 : 1 甲醇/乙酸 的 体 积 （实验成功的关键在于环境的温度和湿度）。 7•脱 水 ： 7 0 % 乙 醇 5 m i n ， 9 0 % 乙 醇 5 m i n ， 1 0 0 % 乙 醇 5min 。涂片室温保存。 基本方案5 端粒酶活性的测定 在淋巴细胞的发育和活化中，端粒酶的活性受到严密的调控。 材 料 （带 V 项 目 见 附 录 1) 细胞
        B S 7 冰冷的洗脱缓冲液V V 冰冷的细胞裂解液 V D E P C 处理过的水 V 1〇 X 端粒酶反应缓冲液 2 0 m m o l / L d A T P 、 d G T P 和 d T T P 混合液 V 引物，用于端粒酶合成 5U /M1 T a g 聚 合 酶 和 10X 反应缓冲液 l m m o l / L d N T P 抗 T a g 的 抗 体 （TaqStart， Clontech)或热启动 T a g 聚合酶 寡核苷酸引物（A T C G C T T C T C G G C C T T T T ) T S N T ( D N A 模 板 ： A A T C C G T C G A G C A G A G T T A A A A G G C C G A G A A G C G A T ) V 6 X D N A 上样缓冲液 1 2 % 非变性聚丙烯酰胺胶 V 1〇 X T B E 或 T A E 缓冲液 匀浆器 P C R 仪 聚丙烯酰胺胶电泳槽 干胶器 磷 光 成 像 系 统 （T y p h o o n 或 S t o r m ) 或同等仪器 分 析 软 件 （Image Q u a n t 或其他类似软件） 1 . 于 1.51111离 心 管 中 用 11111?33悬 浮 1\106个 细 胞 。 4°(：， 8000貧离心5111丨11。用 20〜 IOOm I 冰冷的洗脱缓冲液V 悬浮细胞，继续离心。 2 . 用 20〜 IOOm I 冰 冷 的 细 胞 裂 解 液 悬 浮 I X IO6个 细 胞 或 lM g 蛋 白 质 。冰 浴 30m i n ， 12 OOOg离 心 30miti。对 于 组 织 ，可切成合适大小后，置于细胞裂解液中用匀浆器 勻浆。 3 . 将上清小心转入干净和预冷的1.5m l 离心管中。取 10/xl用来测定端粒酶活性，其余 的上清可置于一80°C 保 存 6 个月到一年。 4 . 在 0.5m l 离 心 管 （或 0.2ml P C R 管）中，加 入 5M 1细胞裂解物， 2. 5M1D E P C 处理过 的水， 2.5M 1端 粒 酶 反 应 缓 冲 液 （1^110 \ 端 粒 酶 反 应 缓 冲 液 ，各 1 4 2〇111111〇1/1^ d A T P 、d G T P 和 d T T P ， 0.5M1 引物），于 22°C 孵育 60min 或 3(T C 孵育 30m i n 。取 2^1端粒酶合成产物用于P C R 扩增，其余的可于一20°C 保 存 2 周 。 5 . 为了定量端粒酶活性，需设置以下对照：①热变性的样品，将细胞裂解液置于85°C 孵 育 I O m i n 以灭活端粒酶；②阳性对照：具有端粒酶活 性 的 细 胞 裂 解 物 （如肿瘤细 胞 29 3 ) ; ③阴性对照：仅细胞裂解液。 6 . 末端标记的端粒酶扩增引物（见辅助方案1)。 7 . 在 端 粒 酶 合 成 产 物 及 对 照 中 ，加 入 共 18M 1 的下列试剂： 2M 1 1 0 X D N A T a g 聚合酶反应缓冲液 2^1 l m m o l / L d N T P
        0. 5/xl [Y-32P ] 标记的端粒酶扩增引物 0•2M 1 20Mmol/L A C X 引物 0. 2^x1 D N A T a g 聚合酶 0. 2M 1抗 T a g 的抗体或热启动T a g 聚合酶 0. 2 4 20]umol/L 寡核苷酸 1/jtl 1〜 10amol/jul T S N T 11. 7]ul D E P C 处理过的水。 在 P C R 反应过程中， T s 和 N T 作 为 扩 增 T S N T D N A 的 引 物 而 T S N T 作为模 板 。此 处 的 T S N T D N A 作 为 P C R 扩增反应和后续定量的内部参照。由 于 T S N T 能 够 和 T s 引物竞争从而影响端粒扩增产物，所以必须通过检测由不同端粒末端转移酶 活性得到的端粒扩增产物来调整加入的 T S N T 的量。使 用 已 知 数 量 的 D N A (0.1 amol) 和一种特 殊 模 板 （R 8 ) 可以定量检测产生的端粒扩增产物，以此来反应端粒 末 端 转 移 酶 活 性 （步 骤 11，可选）。 8 . 混匀，用下列程序作P C R : 起始循环 94°C 30s 28〜 3 2 个循环 94°C 20s 60°C 30s〇 扩增好的 D N A 立即电泳。 9 . 加 入 4 4 6 X D N A 上样缓冲液于每个样品中，混 匀 ，取 8M 1加 入 1 2 % 非变性聚丙烯 酰胺胶的上样孔中， 200V 电 泳 约 1.5h 。当 第 二 种 染 料 xylene cyanol电泳至胶底部 时 ，终止电泳。真 空 中 65°C ， 30m i n 干胶。胶片曝光或感光屏感光。 10. 获取图像。 通 过 磷 光 成 像 仪 （ 用 IOOjum或 者 更 高 分 辨 率 ） 得 到 凝 肢 图 像 ， 或 者 通 过 光 密 度 计 得 到 成 像 的 胶 片 。 一 个 成 功 的 T R A P 测 试 中 ， 所 有 样 本 都 有 一 条 36b p 的 条 带 相 当 于 内 部 参 照 。 此 外 ， 阳 性 对 照 和 定 量 对 照 中 还 有 一 条 从 50b p 开 始 的 以 6b p 为 递 增 幅 度 的 D N A 产 物 梯 状 条 带 ， 而 阴 性 对 照 和 热 处 理 样 本 没 有 > 5 0 b p 的 D N A 产 物 梯 状 条 带 。 11. 测量对照条带及端粒酶产物条带的灰度，用相对于阴性对照的相对比值或总的端粒 酶 产 生 值 （telomeraseproductgeneracted， T P G ) 来表本结果。公式如下： T P G = L - Jo/1C , (C R - C 〇 )/ICR X 1 0 0 式中， L 代表样品X 所有条带的 总 信 号 强 度 ； I。代表热灭活样品的总信号强度； I Q c代表样品X 的内参信号强度； C r 代 表 R 8 的信号强度； C 。代表阴性对照的信号 强度； ICr 代 表 R 8 内参的信号强度。 为 了 比 较 不 同 样 本 ， 端 粒 产 物 和 内 参 待 测 信 号 强 度 的 面 积 大 小 应 该 在 所 有 样 本 中 是 相 同 的 。 T s 引 物 在 扩 增 内 参 D N A 和 合 成 的 端 粒 重 复 序 列 的 扩 增 中 的 竞 争 性 可 以 通 过 扩 增 的 内 参 条 带 的 抑 制 来 定 量 端 料 产 物 ， 通 过 与 已 知 定 量 的 R 8D N A 产 物 相 比 较 ， 可 以 定 性 和 定 量 地 分 析 细 胞 或 组 织 样 本 中 端 粒 酶 的 活 性 。 实验常见问题见表14. 10. 2 。


         

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        来源：丁香实验

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