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    P C R 检 测 小 鼠 T 细 胞 受 体 表 达

    相关实验：分子生物学实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    步骤

     

    基本方案 I P C R 分析小鼠 T C R 基因表达

    材 料

    正常小鼠的组织匀浆或者
    是 H B S S 制备的单个细胞悬液（IO4〜IO7) (附 录 1)

    无菌水
    图 14. 7. I PCR检 测 TC R 基 因 表 达 。 组 织 R N A 和 cDNA准 备 （见 辅 助 方 案 ）。 PCR分 析 TCR 基 因 表 达 有 两 种 方 法 ， 第 一 种 方 法 ，特 异 性 V 区 5 ^ 丨 物 和 一 个 区 引 物 扩 增 所 有 的 含 特 异 V 基 因 的 TC R 转 录 物 。 产 物 同 C 区 基 因 探 针 杂 交 检 测 条 带 。 第 二 种 方 法 ， V 区 5'兼 并 引 物 和 一 个 区 引 物 扩 增 含 相 关 V 区 的 TCR 转 录 物 。 50/xmol/L 评 估 c D N A 质 量 的 引 物 储 存 液 （一80°C 保存）：如 p-action或者是其他 管家基因 SOfxmol/L T C R 引 物 储 存 液 （一80°C 保存）： V 区 5'引物： V P 或 者 Vcx (特异）或 者 是 V p e或 者是 V W (兼并）。 C 区引物： C p uni或 者 Ccx (表 14. 7.1) V 2m m o l /L 4d N T P 混 合 液 （如 P m m e g a ) V I O X P C R 扩增缓冲液 l〇U//xl Tag D N A 聚 合 酶 （如 Perkin -Elmer) 矿物油 n /6 X 凝胶加样缓冲液 T A E 配 制 1 % 〜2 % (m /V ) 琼脂糖凝胶，含 0.5F g/m l 溴 化 乙 锭 （附 录 1) 碱裂解液：〇 .5mo l/L N a O H /1.5m o l / L N a C l
    中和液： lmol/L T r i s * Cl， p H 8.0 (附录 I) /1.5m o l / L N a C l 吸水纸 尼龙膜：如 Magnacharge (Fisher) 或者 GeneScreen Plus (D u P o n t N E N ) V I O X 和 5 X S S C 2500〜 3000Ci/m m 〇l [Cr32P ] C T P 标 记 随 机 引 物 探 针 （C P I 单 元 1 0 . 1 0 ) 检测 c D N A 储存液：如 p-actin 2500〜3000Ci/mmol [cr32P ] C T P 标 记 随 机 引 物 探 针 （CPI 单元 10. 10) Cot 和 Cp 或者是从 c D N A 、基因组克隆来的特异性V 卩探针 V 预 杂 交 溶 液 （现配） V 杂 交 溶 液 （现配） 漂洗液： 0.2X S S C /0.1% (m /V ) S D S (过滤） P C R 仪 ： PerkinElmer480或类似仪器 U V 交 联 剂 （如 U V Stratalinker， Stratagene) 或者是短波 U V 可加热封接袋和真空封接机，或者是杂交瓶和杂交炉 沸水浴 X 射线胶片和放射自显影扫描仪，或 者 是 PhosphorImager盒 和 Phosphorimaging 扫 描 仪 （Moleular Dynamics) 1 . 正常小鼠组织提取R N A ，反转录成 c D N A (见辅助方案）。 2 . 在 分 析TCR基因表达前，先 按 步 骤 3〜8 用适当的引物和探针检测管家基因，如 Pactin的表达。 3 . 在 0.5m l 微离心管里准备反应原液，按照下面的配方乘以总份数，放于冰上： 17. 35jLtl无菌水 0.25M1 SOiUmoiyL 5'特异或是 V 区兼并引物 0 •25jul 50jumol/L 3' C 区引物 2. 5jul 2m m o l / L 4d N T P 混合液 2. 5/xl I O X P C R 扩增缓冲液 0 •165M1 10U />1 T a g D N A 聚合酶。 两 个 P C R 反应分别获得T C R a 和 T C R 卩转录物。吸取 23M 1上述原液到每个微离 心管，放于冰上，加 入 2/ x l c D N A (50p g〜lOOng)。混匀，加入几滴矿物油。 4a. TCRp或 者 是 TCRa V 区引物或者5'和 3' actin引物的扩增参数： 30 个循环： 30s 94〇C 30s 55〇C Imin 72〇 C 0 4b. V ，和 V 卩 e共有引物的扩增参数，以如下的参数进行P C R 扩增： 3 个循环： Imin 94〇C Imin 37 0C Imin 72 0C 2 7 个循环： 30s 94°C 30s 55〇C
    Imin 72〇 C 〇 5 . 从矿物油下吸取25/xl P C R 产物，在干冰上快速冻结。样品中加入适量的6 X 凝胶上 样缓冲液。在含溴化乙锭1. 5 % 〜2. 5 % 的琼脂糖凝胶电泳。 6 . 凝 胶 在 2 〜 3 倍 体 积 的 碱 裂 解 液 中 浸 泡 15m i n ，然 后 在 2 〜 3 倍 体 积 中 和 液 浸 泡 lOmin。通 过 吸 收 10X S C C ，使 D N A 转移到尼龙膜上。至 少 印 迹 12h 。 5 X S S C 漂 洗 。吸水纸吸水5〜lOmin。 U V 交 联 （C P I 单 元 10. 10)，使 D N A 固定在膜上。 7. 5 X S S C 浸湿尼龙膜。转移到杂交袋或者是杂交瓶，加入预杂交液， 42°C 搅拌水浴中 预 杂 交 l h 。弃除预杂交液，32P 标 记 探 针 （106/m l 杂交液）煮 沸 3m i n ，立即加入杂 交液。然后转移到杂交袋或者杂交瓶中42°C 杂 交 12〜16h 。 8 . 杂交膜用洗涤液55°C 洗 5m i n 。重 复 2〜3 次 。印迹膜晾干，包到玻璃纸里。 X 射线 胶片曝光1〜12h 或 者 PhosphorImager盒 显 影 30m i n 〜4h 〇 基 本 方 案 2 PCR检 测 小 鼠TCR可变区的频率 材 料 （其他材料见 基 本 方 案 1) 用于磷相仪和光密度扫描仪的I m a g e Q u a n t 软 件 （Molecular Dynamics) 1 . 选择感兴趣的V 卩或者Vcx引 物 （基 本 方 案 1，步 骤 1〜4)， P C R 扩增样品中所有含 V P 或 者 Vct基因。 2 . 如上，进行第二次P C R ，利 用 5'C p 〜 或 者 是 〜 扩 增 样 品 中 的 所 有 T C R 分子。 3. P C R 共扩增步骤1 和步骤2 中的反应体系，参数如下： 30 个循环： 30s 940C 30s 37〇C Imin 72°C 。 4 . 每 管 P C R 样品，加入凝胶上样缓冲液；步 骤 I 和 步 骤 2 中的共扩增产物在同一块琼 脂糖凝胶上电泳，印迹到尼 龙 膜 上 （见基本方案1，步 骤 5〜6)。 5 . 同 C 卩或者C a 标记探针杂交， X 射线胶片曝光或者是PhosphorImager盒 曝 光 （见基 本 方 案 1，步骤7〜8)。 6.利 用 ImageQuant或者是其他光密度软件对P C R 反应的每个样品的杂交信号定量。 根据下面的公式对样品中含特异V P 或 者 Vct 的 T C R 转录物的总频率做出正确的 评估： % V p - X 或 V c r X 步 骤 1 产物的杂交信号强度 步 骤 2 产物的杂交信号强度 基 本 方 案 3 对小鼠可变区转录物进行PCR定量 对基本方案2 做了些修改，便于准确地对样品中含有特异V 卩或者Vc( 的 T C R 转录 产 物 定 量 （图 14.7.2)。 材 料 （带V 项 目 见 附 录 1) 0.8% (m /V ) 琼脂糖凝胶，含 0.5M g/m l 溴化乙锭的I X T A E 配 制 （附 录 1)

    图 14. 7, 2 质粒 DNA 共 扩 增 。 Molecular Dynamics PhosphorImager 对 Southern 印 记 定 量 。举 例 说 明 ， 5 X 103〜IO6 个 输 入 端 质 粒 模 板 分 子 同 CP杂 交 （得 到 扫 描 A ); Lane 8 包 括 RT (—） 阴性对 照 。质 粒 和 待 测 样 品 用 5'特 异 性 Vp基 因 引 物 和 3'Cpuni基 因 引 物 同 时 进 行 PCR扩 增 ，然后同 CP杂 交 （得 到 扫 描 B) 。扫 描 A 作 标 准 曲 线 ，用 来 比 较 分 子 数 目 和 输 出 端 信 号 （ total pixel) 。 标 准 曲 线 在 3 数 量 级 的 输 人 端 模 板 内 为 线 性 。这 样 通 过 输 出 端 信 号 强 度 就 可 以 定 量 每 个 待 测 样品。 胶 回 收 试 剂 （如 Qiaex II凝胶提取试剂盒， Q i a g e n 或 者 C P I 单 元 10. 5) A P ^ gal+ 克隆载体。来 自 于 P C R -克 隆 试 剂 盒 （如 T A 质 粒 ， Invitrogen) 或者商 业 化 质 粒 （如 pBluescript，或 者 p U C 载体） IOptg/ml t R N A carrier 无菌水配制 1 0 0 % 乙醇，一20°C A m p s， p-gal— coZz•感受态细菌（如 X l -Blue， Stratagene) ，可电转 V 2 X Y T 培养基，含 50/xg/m l 氨苄青霉素 V L B 琼脂平板含50M g/m l 氨苄青霉素， I P T G /X g a l 处理 l m g / m l E .coli D N A (Pharmacia Biotech) l m g / m l R N a s e A 5'C p- 3AC p Rev或者 y C o ^ Co^ 引物 电 穿 孔 仪 器 （如 Gene Pulser， Bio-R a d )
    用于磷相仪和光密度扫描仪的I m a g e Q u a n t 软 件 （Molecular Dynamics) 37°C 细菌培养箱和摇床 1 . 从正常小鼠的脾脏或淋巴结提取R N A ，通 过 反 转 录 得 c D N A (见辅助方案）。扩增 每个感兴趣的V P -C 卩或者是VcrCct转 录 产 物 （见基本方案1 ，步 骤 3〜4)。 2 . 在含溴化乙锭的0 . 8 % 的琼脂糖中跑胶。切取目标条带所在的位置，根 据 Qiaex试剂 说明进行胶回收。无菌水重悬D N A ，浓 度 为 10〜50ng/M l。 3 . 直接克隆到A p r p-gal+ P C R 载体上。或 者 对 扩 增 产 物 进 行 酶 切 （表 14. 7.1)，定向 克隆到传统的A p r(3- gal+ double-c u t 载体中，如 pBluescript或 p U C 载体。 4 . 连接产物进行脱盐，每个连接产物中加I O j u g t R N A 携带体和等体积的一20°C 的无水 乙醇， 4°(：， 10 00(^离心15111丨11。弃去上清， 20] ^无 菌 水 重 悬 沉 淀 。 5. IOm I ( 5 0 % ) 脱盐连接产物电穿孔转化50/xl感 受 态 A m p sp-gal—£：.c〇Zz’ ，转化产物涂 于 含 50M g/m l 氨苄青霉素和I P T G /X g a l处 理 的 L B 琼脂糖平板。 磷 酸 钙 转 化 或 其 他 方 法 （C P I 单 元 10. 13、 10.14、 1 0 . 1 6 ) 可以代替电穿孔 方法。 6 . 挑取克隆到5m l 含 50M g/m l 氨苄青霉素的2 X Y T 培养基中培养过夜。碱裂解法或者 其他方法提取质粒D N A 。 7 . 酶 切 （0 ? 1 单 元 1 0 . 8 ) ，反 应 体 系 含 0.5沁 的 111^/11111^^%( 终 浓 度 微 251^/] ^ ) ， 电泳检测酶切结果。 8 . 测浓度并连续稀释成不同浓度保存。每个浓度取2M 1作为模板，进 行 P C R 扩 增 （见 基本方 案 1，步 骤 3〜4)。 9 . 准备每个实验细胞样品c D N A (见辅助步骤）。在 样 品 c D N A 和 质 粒 模 板 储 存 液 （终 浓 度 为 50ng/M l) 分 别 加 入 E .o ^ D N A ，确 保 扩 增 起 始 ，每 个 P C R 管子的无关 D N A 浓度一致。样 品 和 每 个 T C R 卩或者是 T C R c x 的 标 准 质 粒 D N A 模板一起扩增 (见基本方案1，步 骤 3〜4)。 10•用y c p -3'Cfev或 者 是 引 物 扩 增 样 品 （见基本方案2 ，步 骤 2 和 3)。 11.同一块胶电泳分离步骤9 和 步 骤 1 0 的 P C R 产物，并将其转移 到 尼 龙 膜 上 （见基本 方 案 1 ，步 骤 5 和 6)。 12. 标 记 的 C 卩或者C a 探针与尼龙膜放射杂交（见基本放案1 ，步 骤 7〜8)。 13. Phosphorimaging Scanner或者是放射自显影扫描仪和I m a g e Q u a n t 软件对每道的杂 交信号定量。 14•通过每个泳道质粒标准模板得到的数值（步 骤 9)，得到输入端模板数量和输出端信 号强度的标准曲线。 通过信号强度进行定量，利 用 曲 线 斜 率 （： y = = m x + 6)，得出每个实验样品的输 入端模板数量。 15.关于步骤 1 0 的 P C R 反 应 ，可得到每个实验样品的杂交信号强度和反应体系中最强 信号的比例。对于每个实验样品，步 骤 1 4 得到的数值除以这个比例。 这一步可以对所有的样品和对照规范化。降 低 样 品 中 的 输 入 c D N A 的数量 差异
    基 本 方 案 4 序 列 分 析V (D ) J 区的接头多样性 因为每对P C R 引物的效率都不同，所以只有比较两个不同的文库时，该方法评估 V p 和 J p 基因才有效。 材 料 （带V 项 目 见 附 录 1) 组织匀浆样本或者是溶解在H B S S (附录1 ) 中组织样本的单细胞悬液（IO4〜IO7) £• 菌 株 （如 X l -Blue， Stratagene) V L B 琼脂糖平板含正确的抗生素 噬菌体载体，如 M 13m p 18， 19， 2 0 或 21 硝酸纤维素膜，如 Magnachare (Fisher) [a-32P ] C T P 标 记 特 异 V 卩 寡 核 苷 酸 探 针 （表 14. 7. 2 ; 随机引物标记； C P I 单元 10. 10) [7-32P ] A T P 标 记 特 异 邛 寡 核 苷 酸 探 针 （表 14. 7. 2 ; 多核苷酸激酶标记； C P I 单 元 10.10) V 寡核苷酸预杂交溶液（现配） V 寡核苷酸杂交溶液（现配） 双脱氧法测序试剂（U S Biochemicals) 表 14.7. 2 T 细 胞 受 体 JP寡 核 苷 酸 8 Jp引物 序列 肌 1 肌 2 肌 3 J(31.4 Jpl. 5 肌 6 J132. 1 耻 2 肌 3 JP2.4 J|32. 5 邛2. 6 a. 信息由 Galley 和 Danska 整 理 （1 "5 ) 。 5，-CAC AGA ACT CTT CTT TGG TAA A-3， 5'-CTC CGA CTA CAC CTT CGG CTC A-3， 5'-AAA TAC GCT CTA TTT TGG AGA A-3, 5，-CTA AAC ATT ATT TTT CGG TCA T-3' 5，-ACC AGC TCC GCT TTT TGG AGA G-3， 5'-TTC GCC CCT CTA CTT TGC GGC-3 ^ 5，-TGC TGA GCA GTT CTT CGG ACC A-3' 5'-CGG GCA GCT CTA CT TGG TGA A-3' S7-AGA AAC GCT GTA TTTT TGG CTC A-3^ 5，-AAA CAC CTT GTA CTT TGG TGC A-3， 5'-AC A CAC CCA GTA CTT TGG GCC A-3, 5'-AGT CTG CGA ACA GGG GTG GGT 0 3 ， 1. 靶组织中提取R N A ，反转录得到T C R p c D N A (见辅助方案）。扩 增 T C R 基因转录 产物，（见基本方案1 ，步 骤 3〜4)，克隆到噬菌体质粒载体，转化合适的大肠杆 菌 ， 获 得 文 库 （见基本方案3 ，步 骤 2〜6)。 2 . 转化的噬菌粒涂到正确的菌株上面。进行文库滴定，扩增，保存和筛选转化菌。 关 于 噬 斑 的 细 节 ，噬 菌 粒 文 库 的 处 理 ，噬 斑 转 移 到 硝 酸 纤 维 膜 ，噬 斑 的 杂 交 ，
    参考噬菌粒商家提供的信息， C P M B 第 6 章 或 S a m b r o o k 和 Russell (2001)。 3 . 噬斑在选择性L B 琼脂糖培养平板里培养过夜。转移噬斑到硝酸纤维膜。每块板子准 备一个复板，用复板进行杂交。 4 . 作为阳性对照，通 过 与 [a-32P ] C T P 标 记 的 V 卩探针杂交（对应于步骤1 ) 筛选一个 复板。每个文库准备几块平板，每块平板含有3 X 103〜50X 103个噬斑。 5 . 纤维膜在寡核苷酸预杂交液里孵育2h ， 45°C 水浴，期间不断搅拌。弃去预杂交液， 加 入 含 2 X 106/ml [y-32P ] A T P 标记特异J卩寡核苷酸探针的杂交液，在 45°C 不断搅 拌水浴中，至少杂交16h 。 6 . 轻轻搅拌洗涤液，标记的纤维膜在洗涤液室温漂洗 1〇111丨 11。 49°0洗涤1〇 111丨11。然后按照表14.7.3方法洗 漆 ，每 次 lOmin。最后一^个温度重复一^次，瞭干，曝 光过夜。 7 . 计数每个 J卩探针杂交的噬斑，除 以 V 卩探针杂交的 噬斑总数目，确 定 c D N A 文库中J卩杂交的频率。 8 . 从感兴趣的克隆中得到单链D N A 模板。 该步骤需要纯化单个噬菌体噬斑，经常要重复 筛选低密度平板。 关于噬菌粒噬斑的单链D N A 模板制备的细节， 见 C P M B 7. 3 节 或 者 S a m b r o o k 和 Russell。假如是 质 粒 载 体 （见基本方案3)，双链质粒D N A 也能测序 (见 CPI 单元 10. 25)。 9 . 双脱氧终止法测序（单 元 14. 6)，使 用 通 用 引 物 （如 M 1 3 正向和反向）或 者 是 T C R 特 异 引 物 （如 C puni)。 32P 探针 温度rc 肌 1,1.2,1. 4〜1.6 49 肌 3 52 J(32. 1 57 ■ •2 59 Jp2. 3 62 Jj32.4 65 肌 5 65 J|32. 6 62 辅 助 方 案 CDNA合成用于 小 鼠TCR基 因 表 达 的PCR分析 材 料 （带V 项 目 见 附 录 1) V H B S S 组织匀浆或者是单个细胞悬浮在H B S S (IO4〜IO7个细胞） 10/xg/ml 糖 原 转 运 体 （Boehringer M a n n h e i m ) 7 胍盐溶液 0.5mol/L T r i s * Cl，饱和酚， p H 8.0 (CPI 单元 10.1; R N A 用 p H 4.0 的 Tris 缓 冲液） 氯仿 异丙醇，无 R N a s e 8 0 % 乙醇，无 R N a s e ，一20°C D E P C 处理无菌水 20pg/fxl oligo-dT 引 物 （P romega) V 5 X R T 反应缓冲液
    5m m o l / L 4d N T P 混 合 物 （P r o mega) l m g / m l 分子级牛血清白蛋白（B S A ; BoehringerMannheim) 鸟类成髓细胞性白血病病毒（A M V ) 反 转 录 酶 （R T a s e ; P r o m e g a ; 在 无 菌 D E P C 水中稀释到3U /jul) R N a s e 抑制剂： 33U/jLtl RNasin (P r o mega) l m g / m l 超声处理 E . D N A (Pharmacia Biotech) 1.5m l 无菌微离心管 注 ：所有的溶液要用无菌的D E P C 水配制，灭 活 R N a s e 活性。 1 . 在 1.5m l 无 菌 微 离 心 管 中 加 入 IO4〜 IO6个 细 菌 ，离 心 ， 20〜50M1 H B S S 重悬细菌 沉淀。 2. 5〜IOiU g 糖原载运体在200^1异硫氰酸胍溶液里乳糜化。加 入 200W Tris饱和酚和 40W 氯仿。振荡，室温， 10 O O O g 离 心 15m i n 。吸 取 水 相 到 1.5m l 清洁微离心管中， 再加入等体积的苯酚和1/10体积氯仿。振荡，室温， 10 O O O g 离 心 15m i n 。 3 . 转 移 水 相 层 到 干 净 的 管 子 去 除 残 余 的 苯 酚 ，加 入 等 体 积 的 氯 仿 。振 荡 ， 4°C ， 10 O O O g 离 心 15m i n 。再次吸取水相层到干净的管子，加 入 等 体 积 的 无 R N a s e 异丙 醇 ， 4°C ，最大速度离心15m i n 。用 预 冷 的 无 R N a s e 的 8 0 % 乙醇洗涤沉淀。倒置离 心管，风 干 15m i n 。风干后一70°C 保存或者反转录成c D N A 。 4 . 无 菌 D E P C 水溶解并稀释R N A 为 0.05〜l O O n g / W (每 IO3新鲜分离的细胞可得到约 Ing R N A )〇 5•吸取IOjuiI R N A 溶 液 （0.5〜IOOOng) 到无菌1.5m l 微离心管中，加 入 1.5M l 20pg/yl oligo-d T 引物，轻弹离心管使之混合，瞬时离心。 65°C 孵 育 l O m i n，放于冰上停止反 应 。 6 . 根据下面的配方乘以份数准备R T 原液。 4 4 5\&丁反应缓冲液 2M1 5m m o l / L 4d N T P 混合液 Ijul l m g / m l B S A 1M1 3U/jul A M V RT a s e (共 3U ) 0 •25M1 33U />1 RNasin (共约 8U )〇 每 个 R N A 样品加入8. 25M 1 R T 原 液 ， D E P C 水 补 到 20)ul，瞬时离心。每个c D N A 都 配 无 R T a s e 的平行反应做为阴性对照。 42°C 孵 育 45m i n〜l h 。 7 . 转 移 到 95°C 放 置 5m i n ，冰 上终止反应。加 入 适 量 的 尺 ⑶ 仏 使 得 D N A 总浓度为 50ng/jul。一20°C 储存。

    ​

    来源：丁香实验

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