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基本方案2 将细菌人工染色体（BAC或PAC)引入到哺乳动物细胞和小鼠胚胎中

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

实验材料	纯化的 BAC DNA
试剂、试剂盒	透析缓冲液I 乙醇原核的注射缓冲液 RNase A 灭菌素小鼠胚胎哺乳动物细胞
仪器、耗材	高速离心管高速离心机玻璃离心管含有合适的抗生素的LB培养基培养箱 Qiagen Midi-prep 试剂盒

步骤

1. 从选择性平板中挑取一个克隆，接种到5m l 含有合适的抗生素的L B 培养基中。在 37°C 摇床上培养几个小时，直至混浊。 2.加入 IOOml选择性介质并与0. 5m l 起始液温育，在 37°C 培养 14h ，并轻微振荡 (200r/min)0 3. 将培养液分装入两个50m l 的高效离心管中， 4°C ， 4500g 离心（约相当于5500r/ min) 20min，弃上清保留沉淀。 4 . 将 0.2g RNase A 溶解于20ml Pl缓冲液中，分装入两个管内各IOml Pl和RNase缓冲液。再分别在每个管内加IOml P2缓冲液，温和地摇晃数次使其完全混合，在室温放置5min〇 5. 加 IOml预冷的P3 缓冲液，并迅速温和地摇晃数次使其完全混合。冰浴15min。在 4°C 20 000g (13 000r/min) 离心15min，迅速将上清倒入干净的管内，并再次离心。在两个管内保留上清。 6 . 根据生产商提供的指示将4 ml Q B T 缓冲液加入Qiagen M i d H i p 1 0 0 柱子中，并使其通过重力流过介质。用 IOml Q C 缓冲液清洗柱子2 次。 7. 通过加入预热在65°C 的 Iml Q F 缓冲液将D N A 溶解在15m l 的玻璃离心管中。重复 4 次（共51111)。加入3.51111的异丙醇并在4°0：下 15 000尽（1150(^/111丨11)离心3〇1^11，弃上清，保留沉淀。 8 . 轻柔加入2ml 7 0 % 乙醇（室温）， 4 °C 15 OOOg (11 5 0 0r/ min) 离心lOmin。弃上清，空气干燥沉淀lOmin。用溶解 D N A 。用分光光度计测定D N A 浓度（附录3D )。 9. 如果希望，根据支持方案4 线性化及胶纯化B A C D N A 。 IOa. 将 B A C D N A 导人小鼠胚胎：用 IOOjUgAnl PIB重悬D N A 。在合格的转基因核心仪器上进行显微注射。 IOb. 转染培养哺乳动物细胞：用 pPAC4 或 pBACe3. 6 载体生成的B A C ，按照可选方案中步骤5〜8 进行脂质体转染，对于步骤8 中的G 418，加人 1〜4/^g/m l 灭瘟素 (使用IOOOX储液），最敏感的细胞将在1 周内被杀死。 11. 从抗灭瘟素细胞或转基因小鼠中制备基因组D N A ，用于P C R 和 Southern印迹。 12. 通过P C R 或 Southern印迹确定B A C 中是否存在已知基因或标志，以检测B A C 上的标志和接受细胞系中的等位基因间的多态性。利用临近载体的分子探针（B A C 中的插人结点）估计拷贝数。支持方案4 线性化B A C 和胶纯化BAC 材料（标V 的条目参见附录1) B A C D N A (基本方案2 ，步骤8) JVoi I 或 Asc工限制酶及适当的缓冲液 V 透析液

琼脂糖水解酶 25 :24 :I 0/A 7 V ) 苯酚/氯仿/异戊醇 24 : I ( V A O 氯仿/异戊醇 V 3mol/L乙酸钠 100%乙醇 V 原核注射缓冲液（ Pffi) 50m l 锥形管 1.5ml微量离心管 40°C 、 55°C 和 65°C 水浴 1.为了确疋插入基因是否包含iVoi；[ 或工抑制位点，在酶生产含有I O U 抑制酶的缓冲液消化5吨B A C D N A 。商推荐的环境中用 2. 加载 - 僧職碰并在合适的職下驢，雜可以分辨 5〜2嶋 E B 染胶、显影，然后确定片段大小（具体程序见单元5.工）。用在大多数的 BAC载体中，如果插入的片段不存在論工的作用位点，此时 2 个条带，^ 们分别是载体的条冑（典型的片段大小为 n 〜施 b ) 和插入的条也型的片段大小为 80〜200kb) 。同样，对于 pPAC载体，如果插入片段不存在 ;^ 工作^ 位点，此时可出现 2 个条带，它们分别是 2.4 k b 大小的间隔的载体条带和 14. 贴的插入片段以及附加的载体片段。射 p B A C e 3 .6 载体中的 A5d ，如果插人片段不存在H 作用位点，会有一个条带大小是插入片段长度加 m b 载体（Asci切割载体一次 )。总之，附加条带的出现说明插入片段已经被酶切割，而且BAC不能线性化使用那个酶。^ 果插入片段被两种酶切割，环状BAC必须在后续步骤中使用，所得结果将在后面讨论。 3.用合适的抑制酶消化20吨B A C D N A 。消化完成后，加入凝胶加样缓冲液。 4 . 为脉冲场凝胶电泳实验准备一块低熔点凝胶（基本方案2)。将其放人电泳仪后，载入 B A C D N A 作为常规凝胶。进行支持方案2 的第6 步。 5•将包含B A C 的凝胶切片转移至50m i 锥形管中，在 4°C 环境下透析1〇〜I2h。 6. 移除所有透析缓冲液，在 1.5m l 微量离心管中将凝胶切割成小的片段。 65〇c 加热离心管15〜20min，直至熔解完全，然后放40°C 环境均衡5min。 7. 加入10U (3- 琼脂糖水解酶，用移液管头轻轻混勻。温浴60〜120min，直至没有固体琼脂糖为止。如果120min后仍然存在琼脂糖颗粒，再次放65°C 溶解和40°C 冷却，加人I O U 琼脂糖水解酶，继续温浴。 8.将卩-琼脂糖水解酶置于55°C 加热使其失活。用 25 : 24 : 1 苯酸/氯仿/异戊醇提取 D N A —次，再用24 : 1 氯仿/异戊醇提取D N A 两次 ( 附录 3B )。加人〇.1 体积的 3mol/L 乙酸钠，再加入2 体积100%乙醇置于一2CTC 30min使 D N A 沉淀。 9.在最高速度下微量离心使D N A 复性。完全倒出乙醇，风干沉淀物30min。在 lOOpl PIB中重悬。均分后， .取一'份D N A 样本在脉冲电场中电泳，再用Southern blot检测纯化B A C D N A 的完整性。参考文献： Antoch et al.， 1997; Cabin et al.， 1995; Huxley et al.， 1991; Pavan et al.， 1990; Sikorski and Hieter， 1989 编者： Roger H . Reeves， Deborah E.Cabin， Bmce Lamb， and William M Strauss

来源：丁香实验

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