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方案1 用带有 Fe(Ⅲ) 和 Ga(Ⅲ)的 IMAC 纯化磷酸化多肽

相关实验:用蛋白质组学方法绘制磷酸化位点图谱

最新修订时间:

材料与仪器

步骤

一、IMAC 树脂的制备

在步骤① 〜⑩中,悬浮液与I m l 的反应试剂轻混,室温离心3〇 s,每一■步离心后 均弃上清,再接着做下一步。 ① 在小离心管中,把 I M A C 树脂悬浮于水中,至终浓度约为I m g /m l 。 ② 用水洗树脂
③ 室温下,用溶 于 lmol/L N a C l 的 50m m o l / L E D T A 孵育树脂两次。 ④ 用水洗树脂。 ⑤ 0. lmol/L 乙酸洗树脂。 ⑥ 室温下,在 0 •lmol/L 乙酸中用0. lmol/L FeCl3 或 GaCl3 孵育树脂两次。 ⑦ 用 0. lmol/L 乙酸洗树脂。 ⑧ 用 乙 酸 (0. lmol/L ) : 乙 腈 (3 : 1,体积比)洗树脂。 ⑨ 用 0. l m d /L 乙酸洗树脂。 ⑩ 把树脂悬浮于0. lmol/L 乙酸中。 准备好的 I M A C 树 脂 于 4°C 至 少 可 储 存 40d ,但会降低树脂的使用 效果。

二、多肽样品的制备

 用 蛋 白 酶 ( 胰蛋白酶、 Lys-C 、 Asp-N 等)消化凝胶或溶液中存在的蛋白质样 品,详 见 第 7 章方 案 5。 ⑫ 把 1 份相当于0. 1〜IO p m o l的消化样品稀释到30〜50fxl 0. lmol/L 乙酸中。

三、用 NanoscaleIMAC 纯化磷酸化多肽

⑬ 制 备 I M A C 柱 :将足够量的I M A C 树 脂 ( 来自第⑩步)装人一个长而窄的吸 头 ,填充成一段长15〜20m m 的 I M A C 树 脂 柱 ( I M A C 柱 子 的 制 备 见 “ 附加方案: 用于样品去盐的微柱和Nanoscale I M A C 的制备和使用” )。 ⑭ 用注射器或微量移液器把蛋白质样品(30〜50^x1 ) 慢 慢 地 加 到 (1〜30jLd/min) I M A C 柱子上。 ⑮ 收 集 流 经 Nanoscale去 盐 柱 的 穿 透 液 (Poros R 2 或 Poros.Oligo R 3 的制备? 根 据 在 方 案 1 结 尾 的 “ 附加方案” ),随 后 去 盐 并 进 行 M A L D I -T O F -M S 多肽质谱 分析)。 收集的组分包括所有的未被I M A C 吸附的多肽。 ⑯ 20沁 0. l m 〇 l/L 乙酸洗I M A C 柱子。 这一步和接下来的洗涤步骤中,用注射器产生的轻微正压轻轻地将液 体压过柱子,每一洗涤步骤后把洗脱液丢弃。 ⑫ 用 20沁 乙 酸 (〇 • lm 〇 l/L ) : 乙 腈 (3 : 1,体积比)洗柱子。 ⑱ 用 20W 乙 酸 (0 •lmol/L ) 洗 I M A C 柱子。 ⑲ 用 5沁 p H 10. 5 的洗脱液洗脱滞留在I M A C 柱子上的磷酸化蛋白,或直接把 20/lxI 5 % 甲酸滴到新的 Nanoscale 柱 子 的 上 端 (Poros 10R 2 或 Poros Oligo R 3)。 另外一些洗脱试剂是M A L D I 的基质,如 D H B - 5 0 % 乙腈-2. 5 % 甲酸 或 C H C A - 7 0 % 乙腈-0. 1 % T F A 。用这些洗脱试剂时,洗脱液可直接点到 M A L D I 探针上。 ⑳ 用 IW 的 M A L D I 基质溶液从去盐的I M A C 柱子中洗脱出脱盐的I M A C 洗脱 物 ( 见第⑲ 步)。 M A L D I -M S 分析样品的制备,见 第 8 章 方 案 1。把 5〜8 小滴洗脱液 点 到 M A L D I 靶板上,第 1 滴 和 第 2 滴主要是用来作分析的,可以对洗脱
下来的多肽作nano-E S I 分析,也 可 用 1〜 2沁 5 % 的甲醛+ 1% 甲酸 或 1〜 2W 5 % N H 3 • H 2O + 5 0 % 甲醇对洗脱液加酸化,然后作负离子模式分析 (酸化使用5 0 % 甲酸/ 5 0 % 甲醇)。 附加方案: 用于样品去盐的微柱和Nanoscale I M A C 的制备和使用 这种方法与第8 章中的方案2 和方案3 所详细论述的微柱的制备很相似,是基于 Gobom等 ( 19 9 9 )和 Stensballe等 (2001)提出的原理。任何一种色谱树脂,都可以用 在微柱上,通过紧压GELoader加样吸头的末端,把树脂加上去,上样、洗涤、洗脱是 通过在树脂的上端加液体,利用气压产生低流速,使液体通过柱子,不需要玻璃材料。 附加材料 注意:标记有〈!>的材料的正确处理方法请参见附录3。 色谱 树 脂 ( 如 Poros R l , PorosR2; Poros Oligo R 3 或 I M A C ) GELoader 加 样 吸 头 ( Eppendorf) 甲醇 塑料改造的移液器( Iml) 需要用一个改造后的200/il移液器吸头上端部分把加样器和GELoader 加样吸头连接到一起。 方法 ① 制备色谱树脂浆,每 I m l 甲醇中含有100〜200|ul的色谱树脂。 ② 轻压或弯曲吸管的端部,从而部分阻塞GELoader加样吸头。使色谱树脂被滞留 在柱子中而液体流出。 ③ 从 GELoa d e r吸头顶部加入5jul树脂浆,把 一 个 I m l 注射器连接到G E L o a d e r吸 头的微柱上,并利用注射器施加压力填柱,柱子的高度应为2〜4m m 。 在主方案中所用到的I M A C 柱子需用足够多的树脂来制备长15〜20m m 的柱子。 ④ 用注射器施压,用 10〜20jul 5 % 甲醛通过GELoader吸头冲洗柱子以平衡树脂。 可用T F A 或乙酸代替甲酸,相应地,乙腈代替甲醇。在纳电喷质谱中 推荐使用甲酸和甲醇( 见第8 章)。 ⑤ 多肽或蛋白质样品溶入20〜40沁5 % 乙酸中。 ⑥ 将 5〜20W 的样品加到微柱上,通过注射器轻轻施压,使样品流过柱子。 O 用注射器施压,通过GELoader吸头,用 10〜20jul 5 % 的乙酸洗树脂。 ⑧ 用较小体积的5 % 甲酸/ 5 0 % 甲醇洗脱样品。 洗脱液可收集到小离心管(microfuge tube) 中,沉淀直接加到M A L D I 探针 上,或直接洗脱到纳电喷针管里。后两种情况中,洗脱液的体积只需1〜2jul。 多肽样品的分离,可通过用一系列流动相从微柱上逐级洗脱样品的步骤 得到提高,流动相依次应该为: 5 % 乙酸+ 1 5 % 甲醇, 5 % 乙酸+ 3 0 % 甲醇, 5 % 乙酸+ 5 0 % 甲醇。若 作 M A L D I -M S 分析,则可以用基质溶剂直接将样品 洗脱到M A L D I 探针上,基质溶剂如C H C A 、 S A 或 D H B 溶于3 0 % 〜5 0 % 甲 醇或乙腈中,应该用一系列小滴,而不是大滴液体来沉淀洗脱液( 见 第 8 章 方 案 1)。

来源:丁香实验

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