用蛋白质组学方法绘制磷酸化位点图谱

实验分类：

蛋白质实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

分析磷酸化位点最常见的方法是用同位素（如 32P 或 33P) 来标记蛋白，但是内源 ATP 和 GTP 的存在会导致低效标记，而且放射性标记本身不能精确显示磷酸化位点，所以需要一种替代的方法。MS 正在逐步成为一种非放射性分析磷酸化的选择。

[澳] 理查德 J. 辛普森 (Richard J.Simpson) 主编何大澄主译

来源：丁香实验

操作方法

方案1 用带有 Fe(Ⅲ) 和 Ga(Ⅲ)的 IMAC 纯化磷酸化多肽

一、IMAC 树脂的制备二、多肽样品的制备三、用 NanoscaleIMAC 纯化磷酸化多肽

方案2 在 MALDI 分析之前或之后对磷酸化多肽进行碱性磷酸酶处理

方法 A: 在 MALDI-MS 分析之前在溶液中去磷酸化的方法 1.根据方案 1 中的附加方案，准备两个 nanoscale 去盐柱子（PorosR2 或 PorosR3)。在孵育期间，用 5% 的甲酸保证树脂湿润（第 3 步），GELoader? 吸头的上端作为一个反应室。 2.在每一个反应中，加 20ul 碱性磷酸酶到 50 mmol/L NH4HCO3 中，然后再

方案3 结合固定化金属离子亲和介质和 MALDI-TOF-MS 直接分析方法对磷酸化多肽进行特征分析

一、固定化金属离子亲和柱的制备二、磷酸化多肽与 IMAC 柱的结合三、碱性磷酸酶处理亲和结合的磷酸化多肽四、羧肽酶 Y 消化亲和结合的磷酸化多肽五、质谱

方案4 离线 micro-IMAC 富集磷酸化蛋白实验

一、IMAC 微柱的构建制备二、磷酸化多肽的富集

方案5 用 μLC-ESI-MS/MS 对磷酸化多肽进行分析

1.根据制造商的建议，制备、清洗、平衡 uLC 柱。柱子的流速决定于柱子本身，一般 50um (内径）的柱子为 200nl/min 左右，100um (内径）的柱子则为 500nl/min 左右。通过调节毛细管前方的 T 形分离装置中的毛细管的长度（靠经验确定）进行分流，从而实现对流速的控制。这一装备可用于一般的 HPLC 泵，如能把流速控制在 0.5~4.Oml/min 范围，就可用于毛细管

方案6 MALDI-MS确定酪氨酸磷酸化位点实验

一、SDS-PAGE 分离的 Gab-I 蛋白的消化 1.把通过自显影确定的含有磷酸化蛋白的条带切下来。 2.将凝胶切成 1mm2 的条带，把它们放到检测管中。用特定的不含 Na+、K+的试管消化，否则 Na+、K+的化合物会在 MS 中出现。 3.用消化缓冲液 A 洗凝胶条，37°C，lOmin。 4.用消化缓冲液 B 洗凝胶条，37°C，lO

方案7 用 ESI-MS 确定丝氨酸、苏氨酸的磷酸化位点实验

一、磷酸化蛋白的还原、烷基化和消化 1.在不含 Na+、K+的试管中，用消化缓冲液 A 于 37°C 洗凝胶条 10 min。 2.用还原剂覆盖凝胶条，37°C 下作用 15 min。 3.把还原剂洗去，再加烷化剂，覆盖凝胶条，37°C 下黑暗中放 15 min。避免长时间的放置，因为甲硫氨酸会被碘乙酰胺烷化（Sickmann，etal，2000)。

方案8 用 ESI-MS 确定组氨酸磷酸化位点实验

一、多肽的消化和浓缩二、用 SEQUEST 法则进行数据自动化分析