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        方案12 胶内蛋白质的S-吡啶乙基化实验

        相关实验:电泳分离的蛋白质肽谱和序列分析实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        方法 1: 整块凝胶的还原和 S-吡啶乙基化

        1.保证整块凝胶的正确染色和脱色(见方案 9)。

        2.在 400~500 ml 水中清洗凝胶 3 次,约 1.5 h。

        这一步骤是为了除去脱色液中的乙酸,否则乙酸会反方向地影响还原缓冲溶液的 pH 值。

        3.将凝胶转移到一个干净的器皿中。

        4.将凝胶浸在 50 ml 的还原缓冲溶液中(体积取决于凝胶和器皿的大小)。在 4℃ 孵育凝胶 2 h。

        5.加入 4-乙烯基吡啶到还原缓冲溶液中,终浓度为 2%(体积分数)。避光室温孵育 lh。

        6.加人过量的 2-巯基乙醇(终浓度 2%,体积分数),以终止烷基化作用。

        7.在 400~500 ml 水中清洗凝胶 3 次,约 1.5 h。

        这一步骤是为了除去/5-巯基乙醇,否则会干扰蛋白质水解。

        8.如果蛋白质条带不再可见,重复染色和脱色步骤(见方案 9)。

        方法 2: 蛋白质条带的还原和 S-吡啶乙基化

        1.保证整块凝胶的正确染色和脱色(见方案 9)。

        2.切下目标斑点或条带,放在干净的 1.5 ml 聚丙烯小离心管中。

        3.每次用 Iml 水彻底清洗切下来的凝胶,共 3 次,约 45 min。或者用冷冻干燥离心机完全使凝胶脱水。

        4.从小离心管中弃掉去离子水。

        5.加入足量的还原缓冲溶液,完全覆盖胶(通常 100~200ul)。

        脱水的凝胶吸收还原缓冲液后会膨胀。应确保有足够的还原缓冲液覆盖凝胶。

        6.在 40°C 孵育凝胶 lh。

        7.加人 4-乙烯基吡啶到还原缓冲溶液中,终浓度为 2%(体积分数)。室温下避光孵育 lh。

        8.加人过量的/5-巯基乙醇(终浓度 2%,体积分数),以终止烷基化作用。

        9.用微量移液器或巴氏滴管吸去还原缓冲液,弃掉。

        10.每次在 1ml 水中彻底清洗凝胶,共 3 次,约 45 min。

        来源:丁香实验

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