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        方案5 蛋白质的胰酶消化实验

        相关实验:电泳分离的蛋白质肽谱和序列分析实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        1.冻干的蛋白质底物溶解在 1% 的碳酸氢铵中,控制使用尽量少的溶液体积,以达到较高的底物浓度。

        当蛋白质底物很微量(如小于 1mg) 时,加入 Tween-20 到碳酸氢铵中使其终浓度为 lg/L,否则底物(和酶)会吸附在管壁上,造成样品损失。碳酸氢铵是一种易挥发的缓冲溶液,通过冷冻干燥轻松去除。PH8 的不易挥发的缓冲溶液,例如 0.05 mol/L Tris-HCl (pH8.0~8.3)可以代替碳酸氢铵。

        2.将胰酶加到底物中去。对于变性的蛋白质(比如还原或烷基化的蛋白质),底物与酶的比例为 200:1 到 50:1; 对于天然蛋白质,比例可以高达 1:1; 对于凝胶中的蛋白质消化,不管底物的量是多少,用0.5~1.Oug 的胰酶(一般而言,对于考马斯亮蓝染色的蛋白质用量小于0.5ug)。

        3.设无蛋白质样品的对照反应混合物(如果样品充足,可设不加胰酶的第二份反应液),作为 RP-HPLC 肽段作图的对照。

        4.反应液置于 37°C 保持 16 h(也可过夜)

        5.把样品转移到 RP-HPLC 层析柱上以停止反应,并开始肽谱分析,或把反应液放到冰上以减慢反应。

        或者加入特异性的抑制剂以终止反应。抑制剂如 N-α-甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮(N-α-tosyl-L-lysyl chloromethyl ketone),或 N-甲苯磺酰-L-丙氨酰氣甲酮(N-tosyl-L-pHenylalanine chloromethyl ketone;TPCK),或 PMSF,加人量要多于所用的胰酶量。因为胰酶在低 pH 值的情况下活性不高,也可以通过调节反应混合物的 pH 值为 2~3 来终止反应(比如加人易挥发的乙酸或三氟乙酸)。
        方案5 蛋白质的胰酶消化实验
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        来源:丁香实验

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