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        木本植物蛋白质提取

        相关实验:木本植物蛋白质提取实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        3.1 提取总蛋白质 (见注释 5)

        ( 1 ) 将去塞的 10 ml 空离心管称重。我们选用韧性好的聚碳酸酯旋盖圆底高速离心管。

        ( 2 ) 细胞碎裂:500 mg 新鲜组织(保存在 -80°C ) 在液氮中用研钵和杵捣成粉末状。

        ( 3 ) 用 8 ml 预冷沉淀缓冲液将粉末再次溶解。

        ( 4 ) 将混合物转移到称重过的离心管中。

        ( 5 ) 用 2 ml 预冷沉淀缓冲液漂洗研钵。

        ( 6 ) 将漂洗液也转移到离心管中。

        ( 7 ) 轻轻上下翻转离心管 15s 混合,然后让蛋白质在 -20°C 沉淀 1h。

        ( 8 ) 在 16000 g 离心 15 min ( 见注释 6)。

        ( 9 ) 轻轻倒出离心管里的上清液。

        (10) 用 10 ml 预冷漂洗缓冲液漂洗离心管中的沉淀(除掉残留的 TCA ) ,并让离心管在 -20°C 反应 1h。

        (11) 在 16000 g 离心 10 min ( 见注释 6) 。

        (12) 真空干燥沉淀 2 h。

        (13) 用玻璃棒将沉淀打碎成粉末状。

        (14) 连同干燥的沉淀一起称重离心管。

        3.2 溶解蛋白质

        ( 1 ) 用溶解缓冲液将粉末重悬。每毫克粉末用 10~30 μl 缓冲液溶解。这种缓冲液含有混合的离液剂(尿素、硫 脲)、去垢剂 (Triton-X 100,CHAPS ) 、还原剂 ( DTT) 、载体两性电解质(IPG 缓冲液)。

        ( 2 ) 在室温,400 g 离心 4 min,去除不溶性物质(如细胞碎片)。

        ( 3 ) 将上清液倒入一支干净的离心管。

        ( 4 ) 在室温,400 g 离心 4 min,将上清液倒入一支干净的离心管。

        ( 5 ) 在 -80°C 保存上清液。

        ( 6 ) 根据 Ramagli 等 [8] 描述的方法,浓缩蛋白质可以用超过 6 次的重复定量实验。计算出平均浓度,每根 IPG 胶条上样 300 μg 蛋白质。

        来源:丁香实验

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