花青素表达的定量

1. 瞬时表达研究

植物组织经基因枪转化培养大约 12 h 后，转化细胞开始表现出深红色或者偶尔为深蓝色的斑点。颜色常常会向整个液泡扩散，从外表上看整个细胞都是红色的。在几天时间里，颜色将会增强，并且能在 1~2 周内保持稳定。对于有些细胞来说，其深色液泡内含物中的花青素或者 AVI [ 27 ] 会隐退，或者随着时间的推移慢慢地沉积下来，在这种情况下个体转化细胞更难以判断。尽管大量的细胞积累花青素后，可以用肉眼观察 ，但是统计转化细胞数目需要一台低倍立体显微镜。小麦品种 Cadenza 还在发育的糊粉层细胞，瞬时表达转化小麦 8S 球蛋白启动子控制的玉米 C1 和 R-Lc 基因。只有这两种载体 DNA 按相同摩尔数混合并通过基因枪转化，才能看到花青素积累。培养 3 天后，利用莱卡 MZ8 型立体显微镜拍摄，该显微镜配备莱卡 DFC300FX 型数码相机。

2. 通过吸收光谱对植物提取物花青素进行定量

通过组织提取、535 nm [ 56 ] 处光吸收值等方法，或者通过图像分析来对花青素定量 [57]。可以通过高效液相色谱（HPLC ) 对各种花青素进行定量分析和种类鉴定，或者通过蒸发，将相同的植物提取物浓缩，利用液相色谱质谱（mass  spectrometry ) 联用（LC- MS) 技术进行鉴定 [58]。

(1)  取 200 mg 样品于 3 ml 酸性乙醇或甲醇中（乙醇与 0.1 mol/L 的 HCl 的体积比为 85 : 15，pH 1.0），匀浆组织。

(2)  用 4 mol/L 的 HCl 调 pH 至 1.0，用力振荡 30 min。根据需要，重新调 pH 至 1.0。

(3) 重新振荡 30 min，27000 g，5℃ 离心 15 min。

(4)  将提取物置于 5℃，48 h，27000 g，5℃ 离心 15 min，然后用 0.45 μm 滤膜过滤。

(5) 加酸性乙醇至体积为 3 ml。

(6) 用溶剂设置空白对照，测量 535 nm 处的吸光值，计算花青素总含量。购买合适的标准花青素如花青素-3-O- 葡萄糖苷，绘制标准曲线；参照曲线，对样品中的花青素含量进行定量。

3. 通过成像分析定量花青素

可以通过成像分析，测量色素强度，从而对花青素进行定量。

(1) 取 1 ul 溶于酸性乙醇的已知浓度的系列花青素-3-O-葡萄糖苷（0~400 ug/ml）于载玻片上，用数码相机采集图像色彩强度和色素与花青素-3-O-葡萄糖苷之间的相关系数通过合适的软件进行处理。

(2) 参照上述操作，在相同条件下采集样品图像。