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        重组蛋白质的表达、纯化、复性和定量

        互联网

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        重组蛋白质的表达、纯化、复性和定量

        按Qiagen公司的操作手册进行,具体步骤如下。

        一、重组蛋白质的诱导表达

        1.挑取转化有质粒的单菌落,接种于3ml 选择性LB液体培养基中,37 o C,250 rpm/min振摇培养过夜。

        2.次日将培养过夜的菌液500 μl再接种于10 ml(1: 20)选择性LB液体培养基中,37 o C,250 rpm/min振摇培养至光密度(OD600 =0.6)时,取1 ml样本作为诱导前标本,10000g离心1 min收集菌体沉淀,-20 o C冻存备用。

        3.加入1 mol/L IPTG于菌液中,使IPTG终浓度为1 mM,37 o C,250 rpm/min振摇培养4~5小时。取1 ml样本作为诱导后标本,同上法收集菌体沉淀,-20 o C冻存备用。

        4.将诱导前后菌体沉淀用20 ~ 40 μl PBS(pH= 8.0)重悬,加入等体积的2×SDS上样缓冲液,煮沸加热5 min,SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离,考马斯亮蓝染色3小时后,脱色观察结果。

        5.选取诱导成功的细菌克隆,扩大诱导规模,收集菌体沉淀,于-20 o C保存,准备做下一步分析及纯化。

        二、重组蛋白质的分离纯化

        重组蛋白质的可溶性鉴定

        1.将按上法诱导培养后收集的菌体重悬于裂解液1 (Lysis buffer under native conditions )中,然后在-80 o C低温冰箱中放置10 min。

        2.冰中解冻。

        3.在冰浴上用超声破碎仪破菌6次,每次10 sec,间歇10 sec,电压200-300 V。

        4.10000g,4o C,离心20 min,取上清(为溶液A),-20 o C保存;另将沉淀用同样裂解液1溶解(为溶液B),同样-20 o C保存,供后继分析使用。

        5.将上述A、B溶液和诱导前后的细菌进行SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝染色,比较分析重组蛋白质的溶解性。如果诱导表达的蛋白质位于A溶液中,则为可溶性蛋白;如果是在B溶液中,则为非可溶蛋白。

        重组蛋白质为非可溶性蛋白(变性条件下)的分离纯化

        1. 将菌体沉淀溶于适量裂解液2(Lysis buffer under denaturing conditions)中,室温下搅拌和吹打沉淀,避免泡沫生成。

        2. 10000g,4 o C,离心30 min,收集上清液。

        3. 将Ni-NTA Agarose充填柱子,并连接于Pharmarcia低压液相层析系统,用5倍柱体积的裂解液2平衡Ni-NTA Agarose,调节A280 值至零线。

        4. 将适量上清液上样到Ni-NTA Agarose柱子中,并用lysis buffer冲洗至A280 值低于0.01。

        5. 分别用5~10倍柱体积的清洗液1 和清洗液2(Wash buffer 1 and 2)清洗柱子,直至A280 值低于0.01。

        6.用洗脱液(Elution buffer)洗脱重组蛋白质,在A280 值监测下,收集出现峰线后含有重组蛋白的所有洗脱液。

        三、重组蛋白质的复性、冻干和定量

        纯化后的蛋白用梯度降低的尿素溶液缓慢透析,最终用0.01×PBS透析,透析后的蛋白质溶液经冻干成粉状。以牛血清白蛋白(BSA)为标准,采用BIO-RAD公司蛋白质定量试剂(protein assay)比色测定蛋白质的含量。

         

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