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        MUG 荧光分析

        相关实验:报告基因实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        1. 分别取 25 ul 和 50 ul 组织提取物样品于 96 孔板中(黑色或者白色),包括未转化的对照组织,加 GUS 缓冲液至总体积为 200  ul,混匀。

        2. 加入 100 μl 含 2.5 mg/ml MUG(终浓度为 2 mmol/L ) 的 GUS 缓冲液以开始反应,混匀,加盖。

        3. 37℃ 温浴,反应 5~10  min。取 50 μl 反应液加入另一个含有 200  ul 0.2 mol/L Na2CO3的微型板中,以终止反应。然后按照合适的时间间隔(10 min、20 min、30 min 或 1 h ) ,再取 50  ul,进行相同的操作。

        4. 在 365 nm 的激发光、455 nm 的发射光下,用数显荧光计测量 MU 产物的荧光量。检测样品产生的线性动力学关系,蛋白提取物稀释值及重复测量的荧光量是否相对应。

        5. GUS 活性可以用 pmolMU / min / mg 蛋白来表示。其中 MU 标准物按照荧光读数器线性关系的浓度(如 0~5 umol/L ),通过 0.2 mol/L 的Na2CO3溶液稀释,并置于板上。1 mmol/L 的 MU 甘油溶液应 4℃ 保存,使用前检测有无 Na2CO3的沉淀。

        或者,荧光活性也可以用荧光单位(flu)  / ng 蛋白/min 表示。要把这个值转化为 UidA 蛋白的量,需要用纯化的 GUS 酶(E.coli VII- A,Sigma ) 绘制标准曲线:用 GUS 缓冲液稀释 GUS 酶至 0.1 ng/ul 的工作浓度,在总体积为 50 ul 的 GUS 缓冲液中加入 0~2 ng 的 GUS 酶,按照上面的步骤进行分析。

        6. 有些植物组织含有高水平的内源性 GUS 活性,但可以优化反应条件来检测这些组织的 GUS 活性。

        来源:丁香实验

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