• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        植物提取物中LUC活性的检测

        相关实验:报告基因实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        一、完整组织

        1. 液氮速冻植物组织(5~50 mg),研磨成粉末状。

        2. 100~400 ul 裂解液室温重悬,组织匀浆。

        3. 16000 g,4℃ 离心 15 min,弃掉破碎的细胞。

        4. 检测提取物中的蛋白质浓度。

        5. 立即使用提取物,或者 -80℃ 保存。

        二、原生质体

        1. 50 g 离心 4 min,小份收集(1 x106 ) 原生质体。

        2. 用 2 ml 的 3M 缓冲液重悬,50 g 离心 4 min。

        3. 400 ul 裂解液重悬,短暂涡旋(或者通过 26G 的抽吸)。

        4. 16000 g,4℃ 离心 15 min,沉淀破碎的细胞。检测提取物的蛋白质浓度。

        三、萤光素酶的检测

        1. 取 20 ul 分装的组织提取液于不透明的微型板,以未转化组织的提取物作对照。

        2. 设置光度计程序,加入 100 ul 萤光素酶分析缓冲液,等待 2s,在 10s 内读出萤光素酶的活性值。反应的光强度接近常数的时间约为 1 min,然后慢慢衰减,半衰期大约 10 min。如果光是充足的,读数时间也会缩短。

        3. 用荧光单位 flu /10 s/ mg 表示活性,或者参照提纯的 LUC ( 用来制作标准曲线)的表示方法。

        4. 经常会使用第二种报告基因 (内参对照)如 GUS 进行瞬时表达分析,其检测结果再与对照报告基因的表达对比和进行标准化。需要注意的是,有报道说当植物组织用萤光素酶裂解液提取后,GUS 会被完全激活,但是GUS 缓冲液会影响到 LUC 的活性。第二点需要说明的是,对照载体既不会影响被检测载体的表达,也不会受到培养条件的影响。 一般而言,在基因枪转化或者电激转化前,通过以 1:10 的比例混合对照载体与被检测载体,使得对照载体的表达量保持在较低水平。另外要知道瞬时表达实验需要多次重复,以对数据的统计相关性进行分析。

        植物提取物中LUC活性的检测

        来源:丁香实验

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序