Promega Dual Luciferase®双萤光素酶报

Promega Dual Luciferase®双萤光素酶报告基因检测系统（萤火虫/海肾萤光素酶检测试剂）E1910/E1960

一、产品概述​​

遗传报告基因系统目前广泛用于真核基因表达和细胞生理学的研究。其应用领域包括受体活性、转录因子、细胞内信号传导、mRNA 加工和蛋白质折叠等相关研究。双报告基因常被用来提高实验准确性。“双报告基因”这一术语指在一个系统中同时表达和测量两种单独的报告基因酶。一般来说，“实验”报告基因与特定实验条件产生的效应相关，而共转染的“对照”报告基因的活性则提供了可作为基线响应的内对照。将实验报告基因的活性相对于内对照的活性进行归一化处理，可大大降低细胞活性或转染效率差异造成的实验变异性。同时也可有效消除其他造成变异性的因素（例如移液体积、细胞裂解效率和检测效率等）。因此，一般来说，双报告基因检测法可通过减少外部因素影响，实现对实验数据更为可靠的解读。

Dual-Luciferase®Reporter（DLR™）检测系统（a-c）是进行双报告基因检测的有效方法。DLR™ 检测系统可依次测量单个样品中萤火虫（Photinus pyralis）和海肾（Renilla reniformis，也称 sea pansy）萤光素酶的活性。首先通过添加Luciferase Assay Reagent II（LAR II）产生稳定的发光信号，来测量萤火虫萤光素酶报告基因。在完成对萤火虫发光的定量后，通过向同一管中添加Stop & Glo®试剂淬灭该反应并同时启动海肾萤光素酶反应。Stop & Glo®试剂也可产生源自海肾萤光素酶的稳定信号，此信号在测量过程中会缓慢衰减。在DLR™检测系统中，两种报告基因均可产生线性的检测且其灵敏度可达亚阿托摩尔级（subattomole）。而且两种报告基因在实验用宿主细胞中均无内源活性。此外，DLR™检测系统的整合模式可实现两种报告基因在转染细胞或无细胞转录 / 翻译反应体系中的快速定量。

Promega公司可提供专门为配合DLR™检测系统使用而设计的pGL4系列萤火虫和海肾萤光素酶载体。这些载体可与实验和对照报告基因结合使用，共转染哺乳动物细胞。

二、产品详细说明

1.A.Dual-Luciferase Reporter Assay化学反应过程

由于萤火虫和海肾萤光素酶的进化起源不同，因此这两种酶的结构和对底物的要求各不相同。利用这些差异，可选择性地区分其相应的生物发光反应。因此，使用DLRTM检测系统，可淬灭萤火虫萤光素酶反应的发光信号并同时激活海肾萤光素酶的发光反应。

萤火虫萤光素酶是一种分子量大小为61kDa的单体蛋白，无需翻译后加工即具有酶活性(1,2)。因此，该酶在翻译后可立即作为遗传报告基因发挥功能。通过在需要ATP、Mg²和O₂的反应中氧化甲虫萤光素可实现光子发射(图1)。在常规反应条件下，氧化过程通过转换速度极为缓慢的萤光素化-AMP(luciferyl-AMP)中间体实现。因此，此检测方法的化学反应过程中可产生“闪光”型的光信号，其在底物和酶混合后会迅速衰减。

我们用于定量萤火虫萤光素酶的多种萤光素酶检测试剂均含辅酶A(CoA),以便得到更佳的总体反应动力学(3)。在CoA存在的条件下，萤光素酶检测可产生稳定的发光信号且其强度(图2)显著高于常规检测方法的化学反应过程中所产生的信号。萤火虫萤光素酶检测方法灵敏度极高，且酶浓度可涵盖至少七个数量级的线性范围(图3)。

海肾萤光素酶是一种分子量为36kDa的单体蛋白，从其天然来源海肾(Renilla reniformis)纯化得到的酶由3%的碳水化合物组成(4)。如萤火虫萤光素酶一样，该酶无需翻译后修饰即具有活性，且在翻译后可立即作为遗传报告基因发挥功能。海肾萤光素酶催化的发光反应需要氧气和腔肠动物萤光素(腔肠素)的参与(图1)。

2.A.Dual-Luciferase®Reporter Assay化学反应过程(续)

在DLRTM检测的化学反应过程中，海肾萤光素酶反应的动力学可产生稳定的发光信号，但该信号在测量过程中会缓慢衰减(图2)。海肾萤光素酶与萤火虫萤光素酶类似，其催化的发光反应的灵敏度也极高且线性范围一般可涵盖六个数量级(图3)。请注意，发光反应的有效范围可能会因所用发光检测仪的类型不同(例如96孔与单个样品)而异。

腔肠素的固有特性是它在水性溶液中可发出较低水平的自发光。最初，当酶浓度较低时此缺点影响了检测的灵敏度。此外，一些常用于制备细胞裂解物的非离子型去污剂(例如Titon°X-100)可显著增强腔肠素的自发光。DLRTM检测系统中包含专有的化学物质，可将自发光降低至除了最灵敏度的发光检测仪以外的其他设备均无法检测到的水平。Passive Lysis Buffer的配方可大大降低裂解物组分对腔肠素自发光的影响。此外，DLRTM检测系统还包括两种复溶检测试剂(Luciferase Assay Reagent IⅡ和Stop &Glo°试剂),两者结合使用可抑制腔肠素自发光信号。

图3.萤火虫和海肾萤光素酶的线性范围比较。使用纯化的萤火虫和海肾萤光素酶混合物(用含有1mg/ml BSA的PLB制备)进行DLRT检测。使用Promega公司GloMax20/20发光检测仪测量发光信号。如图所示，使用DLRT检测系统，萤火虫萤光素酶检测的线性范围为8个数量级，且萤火虫萤光素酶报告基因酶的检测灵敏度≤0.1毫微微克(约为10²¹摩尔)。海肾萤光素酶检测的线性范围涵盖8个数量级，且可检测到约0.1毫微微克(约10²¹摩尔)的海肾萤光素酶。

3.B.Dual-LuciferaseReporter Assay检测模式

制备裂解物后可立即对来自每种萤光素酶报告基因酶的发光信号进行定量，而无需进行分样或其他处理。向LuciferaseAssay Reagent Ⅱ中加入一份裂解物后便可启动萤火虫萤光素酶报告基因检测。在萤火虫萤光素酶反应定量结束后，立即将Stop &Glo°试剂添加至样品管中，以淬灭萤火虫萤光素酶发光信号并同时激活海肾萤光素酶。加入Stop &Glo°试剂后，萤火虫反应产生的发光信号可在1秒内降低10⁵倍(至<0.001%的残余光输出信号)(图4)。与此同时，海肾萤光素酶也在这1秒内被完全激活。当使用手动发光检测仪时，定量两种萤光素酶报告基因活性所需的时间约30秒。该操作流程可概括如下：

图5.使用被动裂解或主动裂解流程，在用Passive Lysis Buffer制备的细胞裂解物中测得的萤火虫和海肾萤光素酶报告基因活性的比较。将四种不同类型的哺乳动物细胞用萤火虫和海肾萤光素酶表达载体共转染。通过将贴壁细胞暴露于Passive Lysis Buffer中15分钟(被动裂解)或在Passive Lysis Buffer存在的条件下刮取贴壁细胞随后冻融一次(主动裂解)以制备裂解物。为了便于比较，将报告基因活性相对于通过主动裂解方法获得的每种类型细胞的报告基因活性进行了归一化处理。

三、核心特点​​

1.高灵敏度与宽线性范围​​

检测下限达10^-18 mol萤光素酶，动态范围跨越6-8个数量级，适合低丰度表达分析。

2.内参校正​​

Firefly Luciferase（实验报告基因）与Renilla Luciferase（内参报告基因）共转染，后者用于归一化数据，消除系统误差。

3.快速检测​​

两步反应仅需约20分钟，兼容高通量筛选（如96/384孔板）。

4.即用型试剂​​

提供预混的裂解缓冲液（Passive Lysis Buffer, PLB）和底物（Luciferase Assay Reagent II, LAR II；Stop & Glo® Reagent），简化操作流程。

四、实验流程​​

1.样本制备​​

转染细胞后裂解（使用PLB），离心取上清。

2.检测步骤​​

Firefly Luciferase活性检测：加入LAR II，测量化学发光信号（560nm）。

Renilla Luciferase活性检测：加入Stop & Glo® Reagent淬灭Firefly信号并激活Renilla信号（480 nm）。

3.数据分析​​

计算Firefly/Renilla信号比值，归一化后比较不同处理组的基因表达差异。

五、应用场景​​

◆启动子/增强子活性分析​​

◆miRNA或siRNA对基因表达的调控研究

◆信号通路关键因子（如转录因子）的功能验证

◆药物筛选（如靶向基因调控的小分子化合物）

六、Dual Luciferase®双萤光素酶报告基因检测系统E1910组分表