水相法分离染色质

1. 像聚胺法的第 1、2 步中讲的那样诱导悬浮或单层培养细胞的中期阻遏状态。

2. 细胞在 4℃，1000 g 离心 10 分钟然后重悬浮，典型的制备量为 10 ml 新鲜培养基含 10⁸ 个细胞。

3. 将浓的细胞悬液在冰上放置至少 30 分钟冷却以帮助有丝分裂复合物的完全解离。

4. 4℃ 1000 r/min 离心 10 分钟沉淀细胞。

5. 沉淀用 10 ml 75 mmol/L 的 KCI 重悬浮，4℃ 孵育 20 分钟进行低渗溶胀。

6. 4℃ 1000 r/min 离心溶胀细胞。

7. 将细胞重悬浮于 10 ml 的水相裂解缓冲液中，温和揽拌，冰上放置 5 分钟。

水相裂解缓冲液：

10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4)

120 mmol/L KCl

20 mmol/L NaCl

0.1 % Triton X-100

含 2 mmol/L CaCl₂ 的 0.1 mmol/L PMSF

8. 将悬液温和地反复通过一 25 号皮下注射针头大约 10 次或用 Dounce 匀浆器破碎法使细胞完全裂解（避免产生气泡）。

9. 将破碎的细胞在 4℃ 400 g 离心 3 分钟去除细胞核，上清移至一干净的离心管中。

10. 4℃ 3000 g 离心上清 15 分钟以浓缩染色体。