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        聚胺法分离染色质

        相关实验:染色体分离实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒

        步骤

        有丝分裂中细胞的同步化

        1. 37℃,用合适的含有 FCS,抗生素和其他必要成分的培养基培养细胞。

        2. 收集有丝分裂细胞前 10~16 小时在培养基中以 0.06 μg/ml 的浓度加入秋水仙胺。

        收获细胞并在聚胺缓冲液中裂解

        3. 收获细胞。

        对于悬浮培养细胞(500 ml 培养基),室温 1500 g 离心 5 分钟收获细胞。在室温用聚胺缓冲液清洗三次所得到的沉淀,1500 g 离心 5 分钟收集细胞。

        聚胺缓冲液:

        15 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4)

        0.2 mmol/L 精胺

        0.5 mmol/L 精咪

        2 mmol/L EDTA

        80 mmoI/L KCl

        0.1 mmol/L PMSF(临用前从用 100% 乙醇制备的 1 mmol/L 的贮存液中加入)

        4. 细胞用 20 ml 冰冷的含 0.1% 毛地黄皂苷的聚胺缓冲液重悬浮。

        5. 用 Dounce 匀浆器和 B 研棒进行 10 次温和匀浆裂解细胞(过于剧烈的匀浆会导致染色体明显损伤)。另外也可以将悬液温和地吸到一塑料注射器中,然后推动便其通过 25 号针头(应避免溶液起泡沫)。

        6. 细胞裂解后,取出少量裂解液观察染色质释放情况。在有一滴用来进行 DNA 染色的 2 μg/ml Hoechst 33258 的分离缓冲液溶液的载玻片上,滴一滴裂解悬液。用荧光显微镜观察染色质。

        7. 用 JS-13 ( Beckman),HB-4 (Sorvall),2150 (Herace) 或相似的悬桶式转头在 250 g 离心 1 分钟沉淀裂解液去除碎片。

        8. 取出含有染色体的上清,3000 g 离心 15 分钟。

        9. 将含有染色体的沉淀重悬浮于 5~10 ml 的聚胺缓冲液中。制备的染色体可以在 4℃ 保存。保存 2~4 个星期后观察不到形态的变化;但对于特殊目的的研究(例如酶活性,不稳定蛋白),得到的染色体应立即使用。

        来源:丁香实验

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