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        从M13噬菌体模板合成非固定长度的单链DNA探针

        相关实验:从 M13 噬菌体模板合成非固定长度的单链 DNA 探针

        最新修订时间:

        原理

        在合成过程中,低浓度的放射性标记的 dNTP 使探针的长度限制为 200~300 个核苷酸。但是新合成的 DNA 可通过改变投入的模板量和 dNTP 的浓度使其长度为 100~1000 个核苷酸,如此长度范围内的探针适用于大多数杂交实验。

        材料与仪器

        步骤

        一、材料

        1. 缓冲液和溶液

        洗脱缓冲液(1X SSPE 含 0.5% SDS)

        甲酰胺染色缓冲液

        MgCl2 ( 1 mol/L)

        NaOH (10 mol/L)

        3X 探针合成缓冲液(dATP、dTTP 和 dGTP ( 各 62 pmol/L),0.5 mg/ml 牛血清白蛋白(组分V,Sigma 公司),625 μmol/L DTT,32 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5),6.5 mmol/L MgSO4

        2. 酶和缓冲液

        大肠杆菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段

        3. 凝胶

        含 7 mol/L 尿素的聚丙烯酰胺凝胶(5 %)

        4. 核酸与寡核苷酸

        寡核苷酸引物(M13 噬菌体通用引物或定制的寡核苷酸)

        模板 DNA

        5. 放射性复合物

        [α-32P] dCTP ( 10 mCi/ml,800~3000 Ci/mmol)

        6. 专用设备

        预热至 50℃ 的空气孵箱或水浴摇床

        沸水浴

        一次性接种棒

        多孔(fritted) 柱(Quik-sep 柱,Isolab 公司)

        预热至 57℃ 的加热板

        塑料 snap-cap 管(12 X 17 mm)

        二、方法

        1. 在 0.5 ml 微量离心管中混合:

        单链模板(M13 噬菌体或噬粒 DNA)  

        ( ~0.15 pmol,~0.1 μg/μl)               0.3 μg

        寡核苷酸引物                                  1 μl

        25 mmol/L MgCl                              1 μl

        如可能,可在每次实验中设阳性对照反应,其中含有对照 DNA 模板或经实验证实反应良好的寡核苷酸。

        2. 盖紧管盖,在 57℃ 加热板上温育反应物 5~10 min。

        3. 将微量管从加热板移至冰上,再加入如下混合物:

        3X 探针合成缓冲液                4 μl

        10 mCi/ml [α-32P] dCTP

        ( 比活性 3000 Ci/mmol)       3 μl

        Klenow 片段(约 2.5 单位)  0.5 μl

        轻敲管壁以混合各组分,以最大速度离心 1~2s 使所有液体沉降到管底,37℃ 温育反应物 40 min。

        4. 在进行引物反应的同时,可灌制含 7 mol/L 尿素的 5% 聚丙烯酰胺凝胶(用 1X TBE 缓冲液配制)。凝胶的厚度为 1.5 mm,长度至少为 15 cm,加样孔宽度为 2.5 cm。20~25 V/cm 电泳 15 min,以除去加样孔中的过硫酸胺。

        5. 加入 25 μl 的甲酰胺染料缓冲液,在沸水浴中加热反应物 3~5 min,以终止引物延伸反应。将微量管移至冰上,加入 1 μl 1 mol/L NaOH。

        6. 用注射器吸取 1X TBE 缓冲液,冲掉加样孔中的尿素和松散的聚丙烯酰胺凝胶碎片后,立即将 DNA 样品加至加样孔中。电泳 30 min,电压为 20~25 V/cm,使模板 DNA 与放射性标记探针分离。

        7. 电泳 30 min 后,分离取下凝胶,将凝胶包在 Saran Wrap 包装膜中,通过放射性自显影定位放射性标记的 DNA。将凝胶在 X 线片上曝光 1 min。

        8. 用清洁的剃须刀片从凝胶中切下有放射活性的区带,放入12 X 17 mm 的带弹性盖 (snap-cap) 的塑料管底部,用一次性接种棒捣碎后,加入 1~2 ml 洗脱缓冲液,50℃ 下振荡 >3 h。

        9. 将洗脱液吸入多孔(fritted) 柱,将柱置于塑料 snap-cap 管,用台式离心机离心 1~2 min。用液体闪烁计数仪检测 1 μl 放射性探针的放射活性。

        从M13噬菌体模板合成非固定长度的单链DNA探针

        来源:丁香实验

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