小量培养物中分离 BAC DNA

小量 BAC DNA 是从 5 ml BAC 转化细胞培养物中制备的。DNA 的制备采用碱裂解法。BAC DNA 的产量可达 0.1~0.4  μg，足够用于限制酶切分析、PCR 或 Southern 印迹。

一、材料

1. 缓冲液和溶液

乙醇

异丙醇

DNA提取液

碱性裂解液Ⅰ，预冷

碱性裂解液Ⅱ

碱性裂解液Ⅲ，预冷

STE溶液，预冷

TE ( pH 8.0)

2. 酶和缓冲液

限制性内切核酸酶

3. 凝胶

脉冲场凝胶电泳仪

4. 培养基

含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 培养基

5. 核苷酸与寡核苷酸

脉冲场凝胶电泳所需的 DNA 标准参照物

6. 离心机与转头

Sorvall SS-34 转头或同类产品

7. 专用设备

层析树脂

8. 载体和菌株

BAC 转化的大肠杆菌

二、方法

1. 用 5 ml 含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 培养基培养 BAC 转化的大肠杆菌，37℃ 剧烈振摇过夜。

2. 4℃ 下，2000 g ( 用 Sorvall SS-34 转头，4100 r/min ) 离心 5 min, 收集细菌。小心弃去培养液，用吸头吸净残液。

3. 在每个离心管中加 5 ml 预冷的 STE，用移液器吹悬细菌沉淀。按步骤 2 离心收集细菌。

4. 将细胞重悬于 200 μl 冰冷的碱性裂解液Ⅰ中。将细胞转移至预冷的微量离心管中，置于冰上。

5. 向管中加入 400 μl 新鲜配制的碱性裂解液Ⅱ。轻轻将盖紧的离心管翻转数次。将离心管置于冰上。

6. 向管中加入 300 μl 冰冷的碱性裂解液Ⅲ，轻轻将盖紧的离心管翻转数次。将离心管置于冰上 5 min。

7. 在微量离心机上以最大速度 4℃ 离心 5 min，除去细胞碎片沉淀。将上清移入一新的微量离心管中。室温下加入 900 μl 异丙醇，轻轻翻转数次离心管，混匀。

8. 立即在微量离心机上室温下以最大速度离心 5 min，使核酸沉淀。弃去上清，用 1 ml 70% 乙醇小心漂洗沉淀。室温下离心 2 min，吸去乙醇。在室温下干燥沉淀 5~10 min。将湿沉淀溶于 50 μl TE ( pH 8.0) 中。

9. 用限制性内切核酸酶消化 BAC DNA。

10. 用 PFGE 分析消化的 BAC DNA。电泳要采用大小适合的 DNA 标准参照物。